Background.

Туберкулез (ТБ) остается одной из ведущих причин смертности среди инфекционных заболеваний в мире. По данным глобального доклада ВОЗ, в 2024 году 10,7 млн человек заболели ТБ, что соответствует 131 случаю на 100 000 населения [1]. В Российской Федерации отмечается устойчивая тенденция снижения заболеваемости туберкулезом и в 2024 году показатель составил 34 на 100 000 населения [1]. Тем не менее проблема лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза ТБ – Mycobacterium tuberculosis complex (МБТ) – остается крайне актуальной: Россия относится к числу стран с высокой распространенностью множественно лекарственно устойчивого ТБ (МЛУ ТБ), причем доля МЛУ ТБ среди впервые выявленных случаев в ряде регионов превышает 30–35% [1, 2].

Эффективное лечение ТБ требует своевременной и качественной диагностики, включающей не только выявление возбудителя, но и определение профиля его лекарственной чувствительности с целью назначения адекватной этиотропной [2]. На уровне международных и национальных клинических рекомендаций в качестве современного стандарта рассматриваются молекулярно-биологические методы, прежде всего основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые обеспечивают быстрое обнаружение МБТ и маркеров лекарственной устойчивости [3, 4]. Однако проведение таких исследований требует оснащенных лабораторий и высококвалифицированного персонала, что ограничивает доступность диагностики и удлиняет сроки получения результатов, приводя к задержке верификации диагноза и своевременного начала терапии.

Для решения этой проблемы в мировой практике активно развиваются POC и nPOC технологии, позволяющие выполнять диагностику максимально близко к месту оказания медицинской помощи и непосредственно у постели больного [5]. Для ТБ широкое распространение получили картриджные системы, такие как GeneXpert MTB/RIF и GeneXpert MTB/RIF Ultra, рекомендованные ВОЗ для быстрой идентификации МБТ и определения устойчивости к рифампицину и другим препаратам и внедренные, в том числе, в периферических учреждениях здравоохранения, не оснащенных полноформатными ПЦР лабораториями [6]. В Российской Федерации эти приборы также нашли применение [7] однако ограничения, связанные с поставками импортного оборудования, расходных материалов и сервисным обслуживанием, существенно сузили возможности их широкого использования [8].

Отсутствие на отечественном рынке собственных картриджных тест систем и приборов для выявления МБТ и тестирования лекарственной устойчивости формирует разрыв между потребностями практического здравоохранения и доступной лабораторной инфраструктурой [8]. В этой связи разработка отечественного прибора и первой картриджной тест-системы, обеспечивающей идентификацию МБТ и определение устойчивости к рифампицину, представляет собой важный шаг к повышению доступности, скорости и эффективности диагностики ТБ в Российской Федерации.

Целью данной работы стала разработка и изготовление серийного образца автоматического устройства для экспресс-диагностики ТБ и определения антибиотикорезистентности МБТ. Разрабатываемая система должна обеспечивать выделение нуклеиновых кислот из клинического материала, детекцию ДНК МБТ методом ПЦР в реальном времени, а также анализ мутаций в геноме возбудителя, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам.

Материалы и методы

На базе ФГБУ НМИЦ ФПИ МЗ РФ было разработано автоматизированное устройство для выявления МБТ и определения их лекарственной устойчивости к рифампицину [9, 10]. Новый метод основан на полимеразной цепной реакции в реальном времени с флуоресцентной детекцией, позволяющей одновременно идентифицировать ДНК МБТ и определять мутации, связанные с устойчивостью к рифампицину. Время проведения анализа составило два часа от момента поступления биоматериала до получения окончательного результата. Данное автоматизированное устройство представляет собой диагностический комплекс для полного цикла молекулярного выявления ДНК МБТ и мутаций, приводящих к их лекарственной устойчивости. Конструкция устройства основана на использовании одноразового многофункционального картриджа, содержащего специализированные ячейки для всех этапов анализа – от внесения пробы до проведения полимеразной цепной реакции. Процесс выделения и очистки ДНК реализован с применением технологии магнитных микрочастиц в сочетании с ультразвуковой обработкой, что обеспечивает высокую эффективность пробоподготовки.

Амплификация генетического материала осуществляется в интегрированном ПЦР-чипе, содержащем три независимые реакционные ячейки, что позволяет параллельно анализировать несколько мишеней. Особенностью устройства является его замкнутая конструкция, полностью исключающая контакт оператора с потенциально инфекционным материалом на всех этапах работы. Управление жидкостными потоками реализовано посредством точного поворотного клапана, обеспечивающего автоматизированную подачу реагентов и проб между различными зонами картриджа. Полная автоматизация всех этапов анализа – от подготовки пробы до интерпретации результатов – обеспечивает высокую воспроизводимость исследований при минимальном участии оператора.

Конструкция и принцип работы анализатора

Работа прибора (рис. 1) основана на последовательном выполнении этапов экстракции и амплификации нуклеиновых кислот в автоматическом режиме в замкнутом объеме одноразового картриджа. На первом этапе в анализируемую пробу вносится буфер для разведения и предварительной обработки образца, после чего смесь инкубируют при комнатной температуре. Затем аликвота подготовленного образца переносится в одноразовый картридж, который загружается в прибор; далее оператор запускает предустановленный протокол, и все последующие операции выполняются в полностью автоматическом режиме до получения результатов ПЦР-анализа. По завершении цикла измерений оператору предоставляются данные ПЦР в формате кривых амплификации и/или интерпретированных заключений.

Встроенная система обеспечивает автоматическую экстракцию нуклеиновых кислот с использованием технологии магнитных частиц и фильтрации, что позволяет эффективно очищать ДНК от белков, липидов и других примесей. Очищенный материал автоматически направляется в реакционные камеры картриджа, где осуществляется амплификация специфических участков генома методом ПЦР в режиме реального времени в присутствии праймеров, флуоресцентных зондов и термостабильной ДНК-полимеразы. Термоциклирование реализуется с помощью интегрированного нагревательного блока, обеспечивающего точное поддержание температурных режимов денатурации, отжига и элонгации на протяжении всего ПЦР-протокола.

В процессе амплификации прибор регистрирует нарастающий флуоресцентный сигнал, пропорциональный количеству накопленных продуктов ПЦР, что позволяет проводить детекцию в режиме реального времени и оценивать кинетику реакции. На основании анализа флуоресцентных кривых подтверждается наличие или отсутствие ДНК целевого патогена, а при использовании специфических зондов становится возможной идентификация мутаций, связанных с развитием лекарственной устойчивости. Все этапы – после загрузки картриджа до выдачи результата – выполняются без вмешательства оператора, что минимизирует риск контаминации, снижает влияние человеческого фактора и обеспечивает высокую воспроизводимость и стандартизацию получаемых данных.

Конструкция и принцип работы картриджа

Набор реагентов реализуется в формате одноразового картриджа, внутри которого размещены все необходимые реактивы и расходные материалы для проведения полного цикла анализа. Конструктивно картридж включает ряд функциональных зон, обеспечивающих последовательное проведение лизиса микроорганизмов, выделения и очистки нуклеиновых кислот, а также амплификации и детекции ДНК МБТ методом ПЦР в режиме реального времени.

В состав картриджа входят реагенты для химического лизиса МБТ, представленные концентрированным гуанидинсодержащим буфером, обеспечивающим разрушение клеточных структур и денатурацию белков. При смешивании клинического образца с лизирующим буфером происходит инактивация МБТ и высвобождение их ДНК, при этом гуанидин-изотиоцианат дополнительно способствует последующей сорбции нуклеиновых кислот на кремнийсодержащих носителях. В качестве твердой фазы для выделения ДНК используются магнитные частицы, функционализированные молекулами, способными специфически связываться с нуклеиновыми кислотами (например, диоксид кремния на магнитных микрочастицах), на поверхности которых ДНК микобактерий адсорбируется в присутствии хаотропных агентов. Очистка и высвобождение ДНК

из бактериальных клеток осуществляются с использованием набора буферов для промывки и элюции, содержащихся в отдельных резервуарах картриджа. Последовательное введение промывочных растворов с оптимальным содержанием органических растворителей (изопропанола, этанола) и солей гуанидина обеспечивает удаление белков, липидов и ингибиторов ПЦР, после чего элюирование очищенной ДНК проводится низкоионным буфером, например TE (Tris-EDTA). Для проведения амплификации в картридже также размещен комплекс компонентов для ПЦР в реальном времени: термостабильная ДНК-полимераза, MgCl2, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферная система, а также смесь праймеров и флуоресцентно меченых молекулярных зондов, обеспечивающих детекцию специфических ампликонов МБТ и идентификацию мутаций, ассоциированных с их лекарственной устойчивостью.

Картридж интегрирован с микрофлюидным чипом, содержащим одну или несколько ПЦР-ячеек, в которых осуществляется термоциклирование. Микроканальная система соединяет реакционные камеры с резервуарами, содержащими лизирующие, промывочные и элюирующие растворы, а также ПЦР-реакционную смесь, и оснащена управляемыми клапанами, обеспечивающими поэтапное и контролируемое перемещение жидкостей. В конструкции могут использоваться поворотные или мембранные клапаны, позволяющие направлять потоки из одной зоны картриджа в другую в заданные временные моменты, что обеспечивает полностью автоматизированное выполнение протокола от загрузки образца до получения результата амплификации.

Программное обеспечение

Для обеспечения работы пользователя с аналитическим устройством было разработано клиентское программное обеспечение. Его назначением является запуск анализа с реализацией контроля и индикации этапов его проведения, обработка результатов измерений с построением графиков флуоресцентного сигнала и кривых плавления зондов для двухстадийной «гнездовой» ПЦР, а также последующее хранение, просмотр и редактирование полученных данных. Программное обеспечение поддерживает экспорт результатов анализа во внешние форматы, вывод предупреждений и системных сообщений для пользователя и реализацию функций мониторинга текущего состояния анализатора.

Апробация анализатора и картриджа

Целью лабораторных испытаний являлась всесторонняя оценка работоспособности серийных образцов модульного автоматического устройства (рис. 2), предназначенного для экспресс-диагностики ТБ, а также для определения антибиотикорезистентности МБТ. В рамках испытаний осуществлялась проверка корректности и устойчивости алгоритмов анализа данных на контрольных образцах, оценка межприборной воспроизводимости результатов, а также анализ функциональных характеристик программного обеспечения, предназначенного для управления устройством и обработки данных. Задачи испытаний включали настройку алгоритмов обработки данных на серии контрольных образцов, последующую количественную и качественную оценку согласованности результатов, получаемых на различных экземплярах устройства, и оценку полноты, удобства и надежности реализованного программного функционала в условиях, приближенных к реальной лабораторной практике.

При проведении анализа оператор вносит 1 мл предварительно подготовленного исследуемого образца в специальную ячейку картриджа, после чего картридж герметично закрывается и помещается в портативный анализатор. Дальнейшие операции выполняются автоматически под управлением встроенного программного обеспечения. На первом этапе проводится лизис клеток микобактерий и сорбция ДНК: образец смешивается с лизирующим буфером, затем после инкубации к смеси добавляются магнитные частицы, связывающие высвобожденную ДНК, которые иммобилизируются на стенке реакционной ячейки под действием магнита, в то время как жидкая фракция с примесями удаляется или перераспределяется внутри картриджа.

Затем в автоматическом режиме выполняются промывка и элюирование ДНК. Последовательно подаются промывочные буферы (гуанидинсодержащий, затем изопропаноли этанолсодержащие растворы), при этом частицы с адсорбированной на них ДНК удерживаются магнитом, а промывочные отходы удаляются, что обеспечивает очищение нуклеиновой кислоты. После завершения промывок частицы ресуспендируются в небольшом объеме элюента, и под действием температуры происходит десорбция ДНК в раствор, формируя очищенный элюат.

Полученный элюат автоматически переводится в зону амплификации, где находятся лиофилизированные ПЦР-реагенты; их растворение приводит к формированию ПЦР-смеси требуемого состава. Далее реализуется гнездовая мультиплексная ПЦР с молекулярными маяками, включающая две фазы: предварительное обогащение целевых участков генома с помощью внешних праймеров, последующее разбавление ампликонов и вторая фаза амплификации с внутренними праймерами в асимметричном формате, обеспечивающем накопление одноцепочечных ампликонов.

Детекция осуществляется в режиме реального времени с использованием молекулярных маяков – петлевых олигонуклеотидных зондов с флуорофором и гасителем, которые при гибридизации с комплементарной ДНК переходят в разомкнутое состояние, сопровождающееся появлением флуоресцентного сигнала. Мультиплексный набор зондов обеспечивает одновременное выявление ДНК МБТ и мутаций лекарственной устойчивости за счет разделения сигналов по спектральным каналам и/или по температурам плавления. Интенсивность флуоресценции регистрируется в каждом канале на протяжении ПЦР, при необходимости дополнительно анализируются кривые плавления, а встроенное программное обеспечение сопоставляет полученные данные с заданными пороговыми критериями и формирует заключение о наличии ДНК МБТ и мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью; результаты сохраняются во внутренней памяти прибора и могут быть экспортированы во внешние информационные системы.

В рамках исследования было проведено предварительное испытание клинических образцов от пациентов с ранее полученными результатами ПЦР-диагностики. Среди них 82,8% образцов были положительными на ДНК МБТ, а 17,2% образцов имели отрицательный результат. При применении картриджного метода во всех исследованных случаях были получены результаты, полностью совпадающие с данными стандартной ПЦР.

Среди положительных образцов в 58,3% случаев были выявлены МБТ, имеющие мутации, ассоциированные с устойчивостью к рифампицину. Результаты, полученные с использованием картриджного метода, во всех этих случаях совпали с данными ПЦР по факту обнаружения таких мутаций.

Интерпретация результатов осуществлялась программным обеспечением в автоматическом режиме также, как для обнаружения МБТ. Примеры результатов работы программного обеспечения представлены на рисунках 3 и 4.

Выявление мутаций в целевых участках генома осуществлялось методом анализа кривых плавления. Автоматизированный обсчет результатов амплификации и последующего этапа плавления требует разработки специализированных математических алгоритмов обработки данных. Для оценки корректного прохождения ПЦР был реализован алгоритм, в котором на основании амплитуды кривой накопления флуоресцентного сигнала и положения максимума второй производной (Cp) в экспоненциальной фазе роста кривой выполняется автоматический расчет результата реакции. Для определения наличия мутаций требуется достоверное измерение температур плавления используемых зондов. Автоматическая выдача заключения о наличии или отсутствии устойчивости МБТ к рифампицину, то есть фактически о наличии или отсутствии определенных мутаций в области RRDR (преимущественно) гена rpoB, реализуется в несколько последовательных этапов обработки данных. На первом этапе необработанные флуоресцентные данные плавления подвергаются процедуре сглаживания с целью минимизации шумов и устранения выбросов сигнала, после чего по положению минимума первой производной обработанных кривых плавления определяется температура плавления каждого зонда (рис. 4). Далее, путем сравнения полученных значений температур плавления с референсными данными, заложенными в базу программного обеспечения, выдается итоговый результат о наличии или отсутствии генетических маркеров резистентности к рифампицину.

Conclusion.

В результате проведенной работы создан отечественный анализатор для диагностики ТБ и определения антибиотикорезистентности, ориентированный в том числе на использование в первичном звене здравоохранения. Разработка имеет высокий потенциал для повышения доступности и оперативности лабораторной диагностики, что будет способствовать улучшению исходов лечения и снижению распространенности ТБ. Предварительные исследования подтвердили точность и надежность прибора, показав полное совпадение результатов с существующими ПЦР методами диагностики. Для дальнейшей валидации технологии и получения международной регистрации будут проведены многоцентровые клинические испытания. Кроме того, созданная технологическая платформа открывает возможности разработки новых картриджей для выявления как инфекционных, так и неинфекционных заболеваний в местах оказания медицинской помощи. В настоящее время ведется работа над созданием картриджей, идентифицирующих мутации устойчивости МБТ к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам одновременно, а также для выявления острых респираторных инфекций, ВИЧ и гепатитов А и Б.

1. Всемирная организация здравоохранения. Global tuberculosis report 2024. Geneva: World Health Organization; 2024.
2. Васильева И.А., Тестов В.В., Стерликов С.А., Елисеев П.И., Гусева В.А., Кузнецов Е.О., Самойлова А.Г. Сравнительный анализ результатов тестирования лекарственной чувствительности M. tuberculosis среди случаев туберкулеза в России в 2023-2024 гг. // Туберкулез и болезни легких. 2025; 103(5): 8–14. https://doi.org/10.58838/2075-1230-2025-103-5-8-14.
3. Всемирная организация здравоохранения. WHO consolidated guidelines on tuberculosis. Module 3: diagnosis. Geneva: World Health Organization; 2025.
4. Клинические рекомендации. Туберкулез у взрослых. 2025 / Министерство здравоохранения Российской Федерации. – М., 2026.
5. Kontsevaya I., Cabibbe A.M., Cirillo D.M., DiNardo A.R., Frahm N., Gillespie S.H., Holtzman D., Meiwes L., Petruccioli E., Reimann M., Ruhwald M., Sabiiti W., Saluzzo F., Tagliani E., Goletti D. Update on the diagnosis of tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2024 Sep; 30(9): 1115–1122. doi: 10.1016/j.cmi.2023.07.014. Epub 2023 Jul 23. PMID: 37490968.
6. Лаптева Е.А., Коваленко И.В., Буракевич О.И., Харевич О.Н., Катибникова Е.И., Яровая Т., Горенюк О.Л., Богушевич Н.Ф., Позднякова А.С., Лаптев А.Н., Коровкин В.С., Хотько В., Мушовец А. Диагностическая значимость молекулярно-генетического метода GeneXpert MTB/RIF для диагностики туберкулеза в сравнении с традиционными методами // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. – 2023. – Т. 21, № 2. – С. 118–123. – DOI: 10.25298/2221-8785-2023-21-2-118-123.
7. Носова Е.Ю., Свириденко М.А., Хахалина А.А., Галкина К.Ю., Михайлова Ю.Д., Сафонова С.Г. Ранняя диагностика туберкулеза с использованием теста Xpert MTB/Rif Ultra // Туберкулез и социально значимые заболевания. – 2025; 13(1): 22–29. https://doi.org/10.54921/2413-0346-2025-13-1-22-29.
8. Михайлова Ю.В., Мезенцева Н.И., Стерликов С.А., Михайлов А.Ю., Панкова Я.Ю. Мониторинг и оценка микробиологической диагностики туберкулеза: ресурсы и деятельность микробиологических лабораторий. Социальные аспекты здоровья населения [сетевое издание] – 2023; 69(2): 10. Режим доступа: http://vestnik.mednet.ru/content/view/1471/30/lang.ru/. DOI: 10.21045/2071-5021-2023-69-2-10.
9. Ткачук А.П., Алатырев А.Г., Самойлова А.Г., Васильева И.А. Устройство для автоматического выделения, очистки и амплификации участков ДНК Mycobacterium tuberculosis с регистрацией результатов в режиме реального времени: пат. RU 2837310 C1 Рос. Федерация: МПК G01N 21/64 / заявитель ФГБУ «НМИЦ фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний» Минздрава России. – № 2024100000 ; заявл. 05.08.2024 ; опубл. 28.03.2025. – EDN RFJCBH.
10. Ткачук А.П., Алатырев А.Г., Пономарев В.А., Каникевич Д.В., Дзагоева Ю.К., Казюлина А.А., Тюлькова Т.Е., Самой лова А.Г., Васильева И.А. Разработка и лабораторные испытания опытного образца автоматизированного устройства для диагностики туберкулеза методом ПЦР в режиме реального времени // Научное приборостроение. – 2025. Том 35. – № 4. – С. 61–71.