Background.

Здоровье лабораторных животных («биологических тест-систем») является одним из важнейших критериев качества проводимых исследований. Инфекционные агенты или патологические изменения влекут за собой отклонения от нормы, которые могут быть приняты за результат влияния исследуемых веществ или процессов. [6]. Многие инфекции протекают сначала бессимптомно, либо клинические проявления болезней минимальны, что делает затруднительным быструю диагностику состояния здоровья лабораторных животных. Только продольные исследования, правильная и адекватная организация мониторинга благополучия поголовья, поддержание благоприятных условий содержания являются залогом успеха проводимых в условиях фармакологической лаборатории испытаний. Регулярное проведение мониторинга, анализ и управление рисками, связанными со статусом здоровья лабораторных животных, ведет к достоверности и достижимости ожидаемых результатов исследований. [4].

Цель работы

Осветить ключевые параметры, на которые обращают внимание ветеринарные врачи при выборе поголовья лабораторных животных и качества поставщика; рассмотреть риски и нюансы, с которыми сталкиваются фармакологи испытательных лабораторий; разобрать возможные отклонения и заболевания; описать критерии и признаки, по которым отбираются или исключаются (выбраковываются) животные для экспертизы.

Материалы и методы

Далеко не последним фактором на пути охраны статуса здоровья лабораторных животных (биологических тест-систем) является предохранение от целого ряда болезней, присущих каждому виду животных. Список инфекционных болезней довольно значителен, вот некоторые из них: 1) вирусные болезни – геморрагическая болезнь; инфекции, вызванные рота-, корона- и реовирусами; инфекционный стоматит, Ауески, миксоматоз и др.; 2) бактериальные: бруцеллез, инфекционный ринит, колибактериоз, листериоз, пастереллез, сальмонеллез, стафилококкоз, стрептококкоз; 3) грибковые (микозы): актиномикоз, стригущий лишай, фавус (парша). Лабораторные животные могут болеть также инвазионными и незаразными болезнями [8]. При работе с животными важно знать, понимать природу заболеваний, чтобы своевременно реагировать на отклонения, идентифицировать и управлять рисками для оптимизации работ.

На протяжении девяти лет работы в Курском филиале Росздравнадзора специалистами фармакологической лаборатории регулярно производится набор и пополнение поголовья лабораторных животных вивария (мыши, кролики) для проведения испытаний на токсичность, пирогенность, биологическую активность субстанций и готовых препаратов медицинского и ветеринарного назначения. Ведутся продольные исследования (наблюдения) групп животных с целью определения зависимости влияния поведения персонала на благополучие лабораторных животных.

Четкая последовательная методика по отбору и подготовке лабораторных животных для проведения теста на аномальную токсичность и пирогенность дана в соответствующих статьях действующей Фармакопеи РФ (ОФС.1.2.4.0005.15 и ОФС.1.2.4.0004.15) и несет в себе ряд предметных, неукоснительных к исполнению требований касаемо физиологического состояния, масти, пола, веса животных. Например, для теста «Аномальная токсичность» отбираются здоровые белые нелинейные мыши обоего пола массой 19–21 грамм, ранее не использовавшиеся в эксперименте; для испытания лекарственных средств на пирогенность среди важных требований, предъявляемых к отбору животных, – здоровые кролики одного пола, не альбиносы, с массой тела от 2,0 до 3,5 кг, которые не теряли в массе в течение предыдущей недели содержания.

Таким образом, ветеринарный врач фармакологической лаборатории обязан брать во внимание два основополагающих фактора подбора благополучных здоровых животных: внимательный и ответственный подход при выборе поставщика лабораторных животных (чтобы выбирать из заведомо здорового поголовья питомника) и создание и сохранение благоприятных условий жизнедеятельности в фармакологической лаборатории (при поступлении в виварий).

Поддержание здоровья поголовья и контроль благополучия животных в условиях питомника до поставки в фармакологическую лабораторию

Производя отбор животных для последующего использования в виварии фармакологической лаборатории сотрудники филиала выбирают из заведомо здорового поголовья. Местность благополучна по заразным болезням животных. Персонал фармакологической лаборатории Курского филиала совместно с ветеринарной службой питомника-поставщика работает в тесном взаимодействии, чтобы сделать сотрудничество прозрачным, открытым и доверительным, решать возникающие организационные вопросы поставки поголовья оперативно, эффективно и безотлагательно. По просьбе специалистов нашей лаборатории питомник предоставляет все документы, подтверждающие статус здоровья животных, среди которых – справка об эпизоотическом благополучии по заразным и особо опасным болезням животных, результаты лабораторных исследований, ветеринарные справки и свидетельства. Контроль ветеринарно-санитарного состояния питомника осуществляет государственная ветеринарная служба. Раз в год проводится ветеринарно-санитарное обследование с выдачей ветеринарного удостоверения, подтверждающего право содержания, разведения и реализации лабораторных животных и передачи их в лаборатории и научные организации.

На текущий год питомником-поставщиком разрабатывается и согласовывается с государственной ветеринарной службой график диагностических и лечебно-профилактических мероприятий. Проводится комплекс мер по дератизации помещений, все животные обрабатываются против экзо- и эндопаразитов, производится люминесцентное просвечивание волосяного покрова для диагностики микроспории. Поголовье кроликов проходит дегельминтизацию, вакцинацию и ревакцинацию от геморрагической болезни кроликов (ВГБК), обработку от миксоматоза. Иммунизация животных решает сразу два важных вопроса: сокращение перечня патогенов и защита животных от инфекционных агентов. Микробиологический статус здоровья животных – один из ключевых компонентов качества биологических тест-систем [3].

Экспертиза животных в питомнике-поставщике проводится по следующим показателям: гельминтозы – 1 раз в 15 дней, сальмонеллез – 1 в месяц, кокцидиоз (эймериоз) – 1 раз в месяц. Также персоналом питомника проводится периодический мониторинг кормов по показателям качества, безопасности и питательности, мониторинговое исследование питьевой воды.

При отборе животных в питомнике в обязанности ветеринарного специалиста фармакологической лаборатории входит проведение визуального ветеринарного осмотра. Врач обращает внимание на видимые признаки здорового животного: двигательная активность, кожные и шерстные покровы, ушные раковины, глаза, конечности. Также сотрудники нашей фармакологической лаборатории при проведении осмотра учитывают внешние факторы – явные маркеры и признаки боли у животных (изменение в расположении усов, носа, ушей, щек, прищур), опираясь на так называемую «Шкалу боли» (Langford D.J. и Keating S.C.J.), «единицы поведения» которой указывают на изменение выражения морды у мышей и кроликов по мере увеличения интенсивности боли. Например, по расположению ушей (уши заворачиваются и принимают форму цилиндра или уши отворачиваются от источника звука в сторону спины животного, или уши могут лежать на спине или по бокам головы животного), а также носа животного (носовые щели формируют вид «V», а не «U» или кончик носа направлен вниз к подбородку) можно судить о наличии боли от ее отсутствия до явной, выраженной боли, соответственно.

Создание условий для сохранения здоровья животных и проведение ветеринарно-санитарных мероприятий для поддержания благополучия животных и управления рисками в условиях фармакологической лаборатории

Фармакопея как базовый, основополагающий источник в работе фармакологической лаборатории дает четкий алгоритм действий для специалистов при отборе животных перед испытанием: «Перед испытанием проводят осмотр животных и отбирают здоровых кроликов одного пола, не альбиносов, с массой тела от 2,0 до 3,5 кг, которые не теряли в массе в течение предыдущей недели» (ОФС.1.2.4.0005.15). Каждый ветеринарный специалист понимает, что термин «здоровый» подразумевает отсутствие отклонений от параметров физиологической нормы. Именно поэтому в обязанность сотрудников фармакологической лаборатории входит обеспечение соответствующих параметров окружающей среды (температура, влажность, освещенность, шум, кратность воздухообмена); контроль вспомогательных материалов (корм, вода, подстил) для комфортного нахождения животных; а также регулирование, корректировка поведения персонала для улучшения благополучия животных [5]. Ежегодно проводится ветеринарно-санитарное обследование вивария фармакологической лаборатории, по результатам которого станцией по борьбе с болезнями животных оформляется ветеринарное удостоверение, подтверждающее право содержания, разведения лабораторных животных.

Факторами, обеспечивающими надежность поставки поголовья надлежащего качества, соответствующего критериям отбора для проведения биологических тестов, проводимых в лабораториях Росздравнадзора, являются ветеринарный осмотр и карантинирование животных при поступлении, а также предотвращение возможности перекрестного заражения и контаминации животных при дальнейшем содержании от вновь поступившего поголовья. Сроки карантинирования: для мышей – 14 дней, для кроликов – 21 день. Уход и наблюдение за животными, находящимися в карантине, осуществляются персоналом в спецодежде с инвентарем, закрепленным за данным отделением. Чистка и мойка кормушек, поилок, клеток, инвентаря из карантинного помещения производится в дезинфекционно-моечном отделении вивария после предварительного обеззараживания. В случае появления в карантинном отделении подозрения на инфекционное заболевание животные подвергаются бактериологическому обследованию. При подтверждении инфекции вся поступившая партия животных уничтожается, проводится необходимый комплекс профилактических мероприятий [7].

В фармакологической лаборатории ведется письменный учет процедур, проводимых с животными. В журнал заносятся записи о ежедневных наблюдениях, проводимых процедурах и другая текущая информация. Кроме того, в ранних изданиях Фармакопеи описана процедура проведения теста на «реактивность», которая в большей степени гарантировала исключение «неподходящих» для эксперимента животных еще до введения его для анализа лекарственных средств. Суть процедуры такова: животным, впервые предназначенным для испытания лекарственного средства, вводили внутривенно стерильный апирогенный раствор натрия хлорида, соответствующий требованиям НД. В случае изменения температуры у кроликов более чем на ±0,4°С животных считали непригодными для опыта. Таким образом исключались животные, которые могли давать погрешности в температуре из-за внутренних факторов нездоровья.

В действующем издании Фармакопеи РФ при проведении самого теста на пирогенность существует так называемая «перестраховка» от аномальных расхождений или необъяснимых скачков температуры у животного. А именно, разброс температуры тела у одного и того же животного при начальных измерениях (Т1 и Т2) не должен составлять более 0,2°С (ОФС.1.2.4.0005.15).

Важен постоянный контакт и физическое взаимодействие оператора (фармаколога, ветеринарного врача) с животным. Для того, чтобы физическое взаимодействие не вызывало у кроликов стресса и волнения, которые ведут к изменению физиологических показателей температуры, пульса, дыхания, сердцебиения и др. Животные постепенно, методично приучаются к ручному контакту в период карантинирования еще до перевода в боксы содержания.

Животные, находящиеся в эксперименте, ежедневно, независимо, непредвзято осматриваются ветеринарным врачом и экспериментатором. Все отклонения в состоянии здоровья (поведение и поза, отклонения в потреблении корма и воды, наличие судорог, реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, состояние кожного и волосяного покрова, видимых слизистых оболочек, частота и характер дефекации и диуреза) фиксируются в листе первичной документации эксперимента в графе «Особые отметки».

Многолетняя практика сотрудников Курского филиала показывает, что неукоснительное соблюдение соответствующих, достойных условий содержания (поддержания постоянных параметров микроклимата, воздухообмена, вентиляции, контроль качества дезинфекции и сточных вод), кормления (наличие Удостоверения о качестве и безопасности комбикорма), поения – делают риски возникновения проблем со здоровьем лабораторных животных ничтожно малыми и сводятся к нулю.

Conclusion.

Таким образом, проводя многоэтапный, разноуровневый отбор и дифференциацию поголовья в питомнике и в условиях фармакологической лаборатории, а также придерживаясь комплекса ветеринарно-санитарных мер по мониторингу нежелательных агентов и исключению их влияния на ход испытания, можно с наибольшей гарантией говорить о том, что для биологических исследований отбираются здоровые лабораторные животные, не искажающие результат теста. Реализация ветеринарно-санитарного плана в условиях фармакологической лаборатории способствует достижению достоверных результатов экспериментов, снижению рисков при соблюдении требований действующего законодательства.

1. Keating S.C.J., Thomas A.A., Flecknell P.A., Leach M.C. (2012) Evaluation of EMLA cream for preventing pain during tattooing of rabbits: Changes in physiological, behavioural and facial expression responses. PLOS ONE 7(9): e44437. DOI:10.1371/journal.pone. 0044437.
2. Langford D.J., Bailey A.L., Chanda M.L., Clarke S.E., Drummond T.E., Echols S., Glick S., Ingrao J., Klassen-Ross T., LaCroix-Fralish M.L., Matsumiya L., Sorge R.E., Sotocinal S.G., Tabaka J.M., Wong D., van den Maagdenberg A.M.J.M., Ferrari M.D., Craig K.D., Mogil J.S. 2010. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods 7(6): 447–449. doi:10.1038/nmeth.1455.
3. Акимов Д.Ю., Макарова М.Н., Акимова М.А., Бондарева Е.Д., Хан С. О. Риск-ориентированный подход к проведению мониторинга здоровья обезьян // Лабораторные животные для научных исследований. – 2021. – № 2. DOI: 10.29296/2618723X-2021-02-09.
4. Барышев П. М., Шимановский Н. Л., Максимова Л. В. Зоориски в здравоохранении и ветеринарии, безопасность медицинской практики. Качество медицинской и ветеринарной помощи (на модели лептоспироза) // Проблемы стандартизации в здравоохранении. – 2013. – № 11–12. – С. 17–21.
5. Зайцева М.А., Потапенко Е.Г., Кашина Т.В., Верведа А.Б. Основные подходы к обеспечению качества биологических тест-систем в исследованиях GLP-статуса // Лабораторные животные для научных исследований. – 2020. – № 2. DOI: 10.29296/2618723X-2020-02-03.
6. Коробейникова Е.П., Комарова Е.Ф. Лабораторные животные – биомодели и тест-системы в фундаментальных и доклинических экспериментах в соответствии со стандартами надлежащей лабораторной практики (НЛП/GLP) // Журнал фундаментальной медицины и биологии. – 2016. № 1. С.– 30-6.
7. Университетская комиссия по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных. Руководство по работе с лабораторными животными для сотрудников ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. – URL: https://rsmu.ru/fileadmin/templates/DOC/Vivarium/Ruk_IACUC_RSMU.pdf – Москва, 2015 г.
8. Шевченко А.А. Шевченко Л.В. Болезни и лечение кроликов / А.А. Шевченко, Л. В. Шевченко. – Москва: Аквариум, 2008. – 78 с.