Background.

Вирус псевдобешенства (болезни Ауески) Suid herpesvirus 1 (SuHV-1) относится к виду вирусов рода Varicellovirus подсемейства Alphaherpesvirinae семейства Herpesviridae. Способен вызывать поражение центральной нервной системы и других органов (в т.ч. дыхательных путей) практически у всех млекопитающих, кроме людей и бесхвостых обезьян [1, 2]. Однако среди вирусов группы герпеса имеются представители, патогенные и для человека [3].

Методика, направленная на определение титра вируса на культуре клеток, может применяться для осуществления контроля качества лекарственных средств на различных этапах биотехнологического производства, например, при разработке или производстве вакцин [4]. А также в качестве экспериментальной модели по оценке эффективности новых противовирусных препаратов [5].

Цель исследования

Подтвердить в условиях лаборатории, что методика определения титра вируса псевдобешенства (болезни Ауески) способна обеспечить получение ожидаемых результатов, при этом получаемые результаты воспроизводимы и достоверны.

Материалы и методы

Для проведения исследований были использованы следующие основные материалы:

• вирус болезни Ауески SuHV-1, получен из государственной коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ», паспорт № 423, штамм «ВК», пассаж № 7 в КК ЯДК от 26.10.2020, лиофилизат от 16.11.2020;
• клеточная линия Vero B – эпителий почки африканской зеленой мартышки;
• получена из коллекции лаборатории иммунобиологических препаратов Ярославского филиала ФГБУ «ИМЦЭУАОСМП» Росздравнадзора;
• питательные среды: среда ДМЕМ, содержащая глюкозу 1 г/л; фетальная бычья сыворотка (FBS); антибиотики: пенициллин-стрептомицин (100 МЕ/мл и 0,1 мкг/мл).

При приготовлении ростовой среды для культивирования клеточной культуры в 450 мл среды ДМЕМ добавляли 45 мл FBS и 4,5 мл раствора пенициллин-стрептомицина (100 МЕ/мл и 0,1 мкг/мл). В качестве поддерживающей среды использовали питательную ДМЕМ без FBS и антибиотиков. Культивирование клеточной линии осуществляли в СО2-инкубаторе при температуре (37,0±1,0)°С и содержании углекислого газа (5,0±1,0)%, с влажностью не менее 80%. Клетки пересевали каждые 72–96 часов.

Наработка вирусной суспензии проводилась на клеточной линии Vero B с монослоем 90–100% в поддерживающей среде. Использовали два культуральных флакона: один – для роста вируса (с 0,5 мл вирусной суспензии), второй – в качестве контрольного (с 0,5 мл раствора натрия хлорида 0,9 %) для оценки наличия изменений клеточной линии. После добавления вирусной суспензии на «голый» монослой флаконы инкубировались в СО2-инкубаторе в течение 10 минут при температуре (37,0±1,0)°С без питательной среды с последующей реинкубацией в поддерживающей питательной среде (7 мл) при температуре (37,0±1,0)°С, содержании углекислого газа (5,0±1,0)% и влажностью не менее 80% в течение 72–96 часов до проявления типичной картины цитопатического действия (ЦПД). После отделения всех клеток от флакона, для наилучшего высвобождения вируса из клеток, проводили лизирование клеток с помощью двукратной заморозки и разморозки с последующим центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант вирусной суспензии отбирали, фильтровали через стерильный шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм и использовали для дальнейшей наработки вируса в соответствии с методикой, описанной выше.

Процедура испытания. Для определения титра вируса использовали монослой клеточной культуры Vero B, предварительно выращенный в лунках культурального плоскодонного 96-луночного планшета. Для этого по 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 0,1 106 кл/мл помещали в каждую лунку. Планшет инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре (37,0±1,0)°С и содержании углекислого газа (5,0±1,0)%, с влажностью не менее 80% в течение 24–72 часов.

Для определения титра использовали 5-й пассаж вируса. Разведения от 10-1 до 10-10 готовили в поддерживающей среде с использованием глубоколуночного планшета.

Из планшета с монослоем клеток Vero B отбирали среду. На клетки в соответствующие лунки вносили по 100 мкл приготовленных разведений суспензии вируса; использовали по 4 лунки на каждое разведение. В качестве контроля роста клеточной культуры использовали 16 крайних лунок планшета, в которые вносили по 100 мкл поддерживающей среды. Планшет помещали в СО2-инкубатор. По истечении 48 часов инкубации планшеты просматривали в инвертированном микроскопе на наличие ЦПД вируса на клеточную культуру Vero B.

Расчет титра вируса проводили методом Рида и Менча и выражали в lgТЦД50/мл – десятичном логарифме 50% тканевой цитопатогенной дозы в 1 мл суспензии вируса [6].

Процедура валидации методики. С целью валидации методики определение титра вируса выполнялось двумя испытателями в двух повторах, в один день, на одном и том же пассаже вируса, с использованием одной серии поддерживающей питательной среды.

В качестве валидационных характеристик определялись специфичность, прецизионность и устойчивость (робастность) методики [7].

Специфичность методики подтверждается отсутствием характерных цитопатических изменений в лунках с контрольной культурой клеток (без вируса). Дополнительным подтверждением специфичности может служить достаточный уровень прецизионности.

Прецизионность методики – степень разброса отдельных результатов, оценивалась по величине коэффициента вариации результатов (CV,%), полученных в одинаковых регламентированных условиях для каждого исполнителя.

Устойчивость (робастность) методики – степень внутрилабораторной прецизионности или воспроизводимости результатов, оценивалась по коэффициенту вариации результатов (CV,%), полученных от разных исполнителей.

Статистическую обработку данных проводили с использованием MS Excel.

Результаты и их обсуждение

Определение титра вируса. Характер ЦПД вируса SuHV-1 в культуре клеток Vero B спустя 48 часов после инкубирования представлен полной деструкцией монослоя, формированием клеток округлой формы (рис. 1).

Для расчета ТЦД50 (тканевая цитопатическая доза, вызывающая гибель 50% тест-системы) вируса по методу Рида и Менча применяли расчет процента лунок с проявлением ЦПД для всех разведений вирусной суспензии в каждом повторе (табл. 1).

Метод Рида и Менча подразумевает, что клеточная культура, погибшая при воздействии вируса в данном разведении, погибнет и при более низких разведениях вирусной суспензии. Для расчета титра вируса в lgТЦД50/мл использовалась формула (1):

(1)

где:

Х – титр вируса в lgТЦД50/мл;

А – процент лунок с проявлениями ЦПД при ближайшей к ТЦД50 более высокой дозе (ближайшем меньшем разведении);

В – процент лунок с проявлениями ЦПД при ближайшей к ТЦД50 более низкой дозе (ближайшем большем разведении);

Р – показатель степени наибольшего разведения вируса, которое вызывает 100% ЦПД;

1 – справочная величина поправки для расчета ТЦД50 в 1 мл с учетом количества вируссодержащего материала, содержащегося в 0,1 мл, взятом для заражения одной лунки с культурой клеток [4].

Рассчитанные по методу Рида и Менча значения титра вируса SuHV-1 для всех повторов представлены в таблице 2.

Определение валидационных характеристик методики. В лунках с контрольной культурой клеток Vero B отсутствовали проявления ЦПД, что подтверждает специфичность методики.

Результаты оценки прецизионности (повторяемости, сходимости) и устойчивости (внутрилабораторной воспроизводимости) методики представлены соответственно в таблицах 3 и 4.

Таким образом, прецизионность (повторяемость, сходимость) валидируемой методики составляет не более 3,26 %, а устойчивость (воспроизводимость) – не более 1,65 %.

Conclusion.

В результате валидации методики определения титра вируса псевдобешенства (болезни Ауески) на культуре клеток Vero B было установлено, что методика специфична, имеет удовлетворительный уровень повторяемости (сходимости) и устойчивости (внутрилабораторной воспроизводимости). Применение методики обеспечивает получение ожидаемых результатов, при этом результаты воспроизводимы и достоверны.

1. Burdinskaya O.N. Pathogenicity spectrum of the causative agent of Auyeski disease. Russian Veterinary Journal. 2013: 3. – URL: https://cyberleninka.ru/article/n/cpektrpatogennosti-vozbuditelya-bolezni-aueski (date of reference: 06/08/2024). (In Russ.).
2. Syurin V.N., Samuilenko A.Ya., Solovyov B.V. Fomina N.V. Viral diseases of animals. – Moscow: VNITIBP. – 928 p. (In Russ.).
3. Takashima G., Otsuka H. Patogenesis of animal herpesviruses to human. Nippon Rinsho. 2000; 58(4): P. 957–961.
4. Ivanov A.V., Yusupov R.H., Chernov A.N., Yusupova G.R. On the issue of developing a vaccine against pig Auyeski disease. Scientific notes of the Bauman KGAVM. 2015: 4. – URL: https://cyberleninka.ru/article/n/k-voprosu-razrabotki-vaktsiny-protiv-bolezniaueski-sviney (date of reference: 06/08/2024). (In Russ.).
5. Mironov A.N. Guidelines for conducting preclinical studies of medicines. Part one. / A.N. Mironov [et al.]. – Moscow : Grif i K, 2012. – 944 p. (In Russ.).
6. MI 3.3.2.1121-02. 3.3.2. Medical immunobiological preparations. Organization of control over compliance with the rules of storage and transportation of medical immunobiological preparations. Methodical instructions (approved by the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation 04.04.2002). URL: https://legalacts.ru/doc/mu-3321121-02-332-meditsinskie-immunobiologicheskie-preparaty-organizatsija / (date of access: 06/08/2024). (In Russ.).
7. The State Pharmacopoeia of the Russian Federation, XIV ed. The General Pharmacopoeia article of the OFS.1.1.0021.18 “Validation of microbiological techniques” (approved and put into effect by Order No. 749 of the Ministry of Health of the Russian Federation dated 31.10.2018 “On Approval of General Pharmacopoeial Articles and Pharmacopoeial Articles and Invalidation of Certain orders of the Ministry of Health and Medical Industry of the Russian Federation, the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation and the Ministry of Health of the Russian Federation”).