Background.

По имеющимся данным, 10–15% всех смертей на поле боя происходит из-за невозможности адекватной остановки кровотечений [1].

Этапу окончательной остановки кровотечения, за редким исключением, всегда предшествует этап временного гемостаза. При хирургических вмешательствах временная остановка кровотечения обычно достигается пережатием сосудов с помощью зажимов или за счет использования баллонного катетера, который помещается в просвет сосуда и остается раздутым до наложения шва или его перевязки. Однако это часто сопровождается техническими трудностями, что мешает ходу операции и увеличивает кровопотерю. Пережатие сосуда зажимами способствует повреждению интимы сосудов и провоцирует развитие тромботических осложнений во время оперативного вмешательства, а также в раннем послеоперационном периоде.

В полевых условиях основными методами временной остановки кровотечения из конечностей являются турникеты и компрессионные повязки [2].

Остановка кровотечений является одной из актуальнейших задач хирургии. Обычно кровопотеря возникает в результате травмы, связанной с повреждением сосуда. Известно, что в зависимости от величины кровопотери, вида сосуда, от того, какой орган кровоснабжался поврежденным сосудом, могут возникнуть различные нарушения в организме человека – от незначительных до прекращения жизнедеятельности, т. е. гибели организма.

В ряде случаев, когда доступ к поврежденному сосуду по какой-то причине невозможен, или кровотечение носит диффузный характер, допускается временная тампонада полости раны, по крайней мере до принятия решения о способе окончательного гемостаза. В медицинской практике тампонада часто дополняется использованием гемостатических препаратов. [3]. Они действуют направлено, могут применяться при разных видах кровотечений и пользуются большим спросом в хирургии. У каждого антигеморрагического материала есть как положительные, так и отрицательные стороны, но главная роль всех используемых местных гемостатиков заключается в создании и ускорении этапов образования тромба [4].

К наступлению этапа окончательной остановки кровотечения в ране не должно оставаться никаких инородных тел, отсутствовать токсическое воздействие на ткани, остатки гемостатического средства не должны обладать эмбологенным эффектом после запуска кровотока. В связи с этим в хирургическую практику активно стали внедрять жидкие эмболизирующие системы. Известно множество клинических ситуаций, например, ранения, травмы, послеродовые кровотечения, желудочно-кишечные кровотечения, кровотечения при хирургических вмешательствах и т. д., при которых эмболизация должна быть обратимой [5,6]. Для этого используются вещества с управляемой биодеградацией, а также препараты на основе термочувствительных полимеров. Несмотря на значительное количество предлагаемых вариантов, подавляющее большинство используемых сегодня средств и композиций не вполне отвечают всем необходимым требованиям современной хирургии.

Цель работы

Описать технологические особенности при создании медицинского изделия в виде геля, которое позволило бы эффективно и быстро остановить кровотечение и в то же время обеспечить обратимость эффекта после взятия ситуации под контроль.

Материал и методы

Известны примеры и назначение композиций на основе полоксамеров, применяемых в медицинской практике. Они применяются для послеоперационного противорецидивного лечения в онкологии [7], в качестве носителя для замедленного высвобождения лекарственных средств, как основа для изготовления нанопрепаратов для лечения ряда заболеваний [8], в качестве композиций для репарации ран, и т.д. Примечательно, что блок-сополимеры обладают чрезвычайно низкой токсичностью и отсутствием иммуногенности1, а также им характерны уникальные поверхностно-активные свойства.

Полоксамеры представляют собой триблок-сополимеры с центральным блоком гидрофобного полипропиленоксида, окруженным двумя блоками гидрофильного полиэтиленоксида [9].

В зависимости от общей молекулярной массы и соотношения размеров полиоксиэтиленовых и полиоксипропиленовых блоков, различные виды полоксамеров представляют собой жидкости, пасты или воскоподобные твердые вещества.

Среди них следует выделить полоксамер 407, который является неионогенным поверхностно-активным веществом со свойствами обратимого гелеобразования выше определенной концентрации полимера и определенной температуры. Т.е., с повышением температуры увеличивается его вязкость. Формула вещества представлена на рисунке 1.

Молекулярная масса полоксамера 407 приблизительно составляет 12,6 кДа (два блока полиэтиленоксида, состоящие из 101 звена этиленоксида, и один блок полипропиленоксида, состоящий из 56 звеньев пропиленоксида). В Российской Федерации блок-сополимеры того же класса производятся под групповыми торговыми марками Проксанолов® (ООО «ВИЗУСМЕД») и Эмуксолов® (ФГУП ГНЦ «НИОПИК»).

На основе полоксамера 407 в США был создан термочувствительный полимерный гель «LeGoo» (Pluromed, Вобурн) [10]. При комнатной температуре это вязкая жидкость, пригодная для инъекционного введения, которая при температуре тела превращается во временную густую массу – полимерную пробку. «LeGoo» состоит из 20% (имеется в виду весовой процент в физиологическом растворе) очищенного полоксамера 407. Это вещество в соединении с водой в определенной концентрации способно создавать нетоксичный биосовместимый гель, который обладает обратными термочувствительными свойствами (т.е. с повышением температуры его вязкость увеличивается). При этом температурный фазовый переход происходит без изменения химического состава продукта.

Алгоритм работы с «LeGoo» следующий: в нужном месте производят артериотомию. Проксимально в просвет сосуда заводят канюлю и вводят препарат против кровотока. Когда «LeGoo» вводят в кровеносный сосуд, его вязкость из-за повышения температуры увеличивается, и образуется полимерная пробка, которая временно блокирует кровоток. Далее «LeGoo» таким же способом вводится дистально, чтобы остановить ретроградное кровотечение2. Иллюстрация алгоритма представлена на рисунке 2.

Когда кровотечение из сосуда остановлено, производятся необходимые манипуляции (формирование анастомозов, вшивание сосудистых заплат и т. д.)

Образовавшаяся гелевая пробка растворяется самостоятельно примерно через 15 минут. Но кровоток можно восстановить и раньше, путем введения холодного физиологического раствора с температурой 4 градуса по Цельсию, или охлаждения области вмешательства, например, стерильным льдом. Происходит быстрый обратный переход в жидкую фазу (золь), препарат растворяется в крови и, потеряв концентрацию, а следовательно, и свойства, в дальнейшем выводится с мочой в неизмененном виде. Все описанные выше трансформации представлены на рисунке 3.

В количествах, достаточных для окклюзии мелких сосудов, диаметром до 4 мм, гель «LeGoo» доказал свою эффективность и безопасность (нетоксичность) [11]. Однако применение геля на более крупных сосудах, например, на бедренной артерии, невозможно. Простое повышение концентрации для увеличения продолжительности существования гелевой пробки, без дополнительных мер, вызывает местный токсический эффект, что проявляется в воспалении стенки сосуда.

Уникальные свойства геля послужили причиной выбора полоксамера 407 в качестве основного компонента композита, который был разработан в ходе данной работы.

С целью приготовления собственной термоуправляемой композиции для временной остановки кровотечений, помимо полоксамера, мы добавили в ее состав неионогенные, высокомолекулярные, водорастворимые полимеры полиэтиленоксида – Polyox, в качестве загустителя и адгезивного компонента.

Для определения температуры образования гелей из жидкой мезоморфной фазы различных концентраций (14–30 мас. %) блок-сополимера этиленоксида и пропиленоксида, использовали стенд – модель in vitro. Лабораторные пробирки заполняли 5 мл композиции различной концентрации и инкубировали при фиксированных температурах в водяном термостате. Температуру гелеобразования определяли визуально, переворачивая пробирки вверх дном.

Чтобы получить исходную композицию, готовили водный раствор блок-сополимера этиленоксида и пропиленоксида в концентрации 15–30 мас.%. В полученный раствор вводили полиэтиленоксид в концентрации 0,1–2,0 мас.%. В качестве консерванта использовали раствор полигексаметилена бигуанида гидрохлорида в концентрации 0,002 мас.%.

В зависимости от задач, в полученную композицию могут быть введены дополнительные компоненты: поливинилпирролидон в количестве 5–20 мас.%, рентгеноконтрастные вещества в количестве 20–30 мас. % или водорастворимые соли хитозана в количестве 0,1–4,0 мас.% и др.

Например, для приготовления 1 кг 30 мас.% рентгеноконтрастной композиции к 671 г воды добавляют навески 300 г блок-сополимера этиленоксида и пропиленоксида, 9 г хлористого натрия и 20 г полиэтиленоксида. Создание композита из компонентов проводят при помощи верхнеприводной мешалки при температуре +4°С и непрерывном перемешивании до полного растворения ингредиентов и образования прозрачного раствора. Полученную вязкую композицию выдерживают в статических условиях в течение одних суток. Готовую композицию хранят в холодильной камере при температуре +4° – +6°С.

Для испытания свойств полученной композиции помимо определения температуры фазового перехода нами было проведено несколько предварительных тестов сравнения на адгезивные свойства.

Для оценки предела прочности на растяжение разработанной композиции в сравнении с гелем «LeGoo» использовались портативные весы, прочно закрепленные на исследовательском столе. К площадке весов крепилась гладкая стеклянная пластина (в нашем случае 100 100 мм). Далее из предметного стекла вырезался квадрат со стороной ~25,6мм (6,55см2), в центре которого закреплялась скоба для подъемного устройства. Перед испытанием прилегающие поверхности тщательно очищались и обезжиривались. На рабочую сторону стеклянного квадрата по центру наносилось 0,1 г исследуемой композиции в гелеобразном состоянии. Стекла сближали между собой с усилием, пока из капли геля не образовывался диск, диаметром 2 см. После тарирования весов стеклянные пластины отрывали друг от друга с силой, перпендикулярной плоскости, до момента разрушения связей, который оценивался по обнулению показаний весов на видеозаписи. Во время приложения усилия весы считали в обратном направлении вплоть до разрыва. Самое весомое замеченное значение записывалось, и, без учета времени приложения усилия, через систему килограмм-сила переводилось в Паскали. Визуально исследование выглядело как представлено на рисунке 4.

Для определения интегративного показателя адгезивных свойств разработанного геля фиксировалось время, за которое пробка, состоящая из композита, будет выдавлена из сосуда под действием давления жидкости, соответствующего системному артериальному.

Таким образом, для определения сопротивления обтурирующей «пробки» из созданного композита напору крови был взят блок из мягкого полимера, внутри которого проходят силиконовые имитации сосудов. В данном случае внутренний диаметр фантомных сосудов был 3, 5, 8 и 11 мм. (рис. 5).

В дистальную часть силиконовых сосудов посредством канюли вводился состав, находящийся в жидкой фазе. После гелеобразования «сосуд» заполнялся подогретой до 37°С водой, а затем через подключаемую магистраль «сосуды» соединялись с полиэтиленовым пакетом с водой, нагретой также до 37°С, в котором посредством стандартной манжеты с манометром и резиновой груши, создавалось давление 120 мм. рт. ст, что соответствует обычному систолическому давлению здорового человека.

Results.

Результаты эксперимента по определению температуры гелеобразования приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, температура гелеобразования является критическим фактором и определяется концентрацией блок-сополимера. Механическая прочность геля также пропорциональна концентрации блок-сополимера, поэтому предпочтительно использовать его максимальную концентрацию (рис. 6).

Как следует из результатов экспериментов, более высокая концентрация вещества в растворе обеспечивает выраженную механическую прочность гелевой пробки. Однако при концентрациях блок-сополимера выше 30 мас.% гелеобразование может спонтанно произойти вне человеческого тела при температуре окружающей среды. При концентрациях ниже 15 мас.% температура гелеобразования близка к температуре человеческого тела, и при температуре окружающей среды ниже +19°C гелеобразование может не произойти. Поэтому нами была выбрана оптимальная концентрация блок-сополимера этиленоксида и пропиленоксида 15–30 мас. %, которая обеспечивала оптимальные механические свойства геля. Стоит отметить, что при понижении температуры ниже определенной для фазового перехода, гель превращается в жидкостноподобное агрегатное состояние (золь). На это свойство не влияет количество циклов заморозки/ разморозки композиции. Но после повторного контакта с водой или кровью, состав сразу же начинал необратимо деградировать, что исключало его повторное применение.

Определение предела прочности на разрыв дало следующие результаты: для геля «LeGoo» давление на разрыв составило около 0,12 Мпа, в то время как для созданной композиции эта величина находилась возле отметки в 1 Мпа, что статистически достоверно (р<0,5) отличало адгезивные качества сравниваемых медицинских изделий.

При исследовании интегративного показателя сопротивления гелевого конгломерата давлению жидкости в системе стенда в стандартизованных условиях, гель с рецептурой «LeGoo», как и указанно производителем, успешно сдерживал давление в сосудах малого диаметра (4 мм) в течение 6–15 минут (рис. 7).

Композит, созданный в ходе этой работы, продемонстрировал возможность эффективно удерживать напор жидкости с давлением до 120 мм рт. ст. в сосудах диаметром 8 и 11 мм на протяжении 100 минут, что достоверно (р<0,5) превосходит показатели геля «LeGoo» (рис. 8).

Выводы

1) Определен состав композитного материала на основе полоксамера 407 и полиэтиленоксида 303, который позволил создать эффективное медицинское изделие для временного гемостаза.

2) Определено содержание модифицирующих добавок для различных целей применения полученной композиции.

3) Разработанный и опробованный в условиях in vitro кровоостанавливающий гель обладает статистически достоверно более выраженными адгезивными свойствами и значительно превосходящей механической прочностью, чем подобные изделия на основе однокомпонентного состава.

_______________________________________________________________________

1 URL: https://assets.lgcstandards.com/sys-master%2Fpdfs%2Fh29%2Fh03%2F10471409451038%2FSDS_EPP2164030_ST-WB-MSDS-4399008-1-1-1.PDF (28.08.2023).

2 URL: http://cedit.aphp.fr/hospital-based-hta-levaluation-de-technologies-de-sante-a-lhopital/point-sur-le-gel-hemostatique-legoo/ (20.08.2023).

1. Tsoi I.E. Vasina A.A., Shugaev C.B., Zakharchenko E.V., Toloknova A.S., Sementsov I.V. Modern methods of stopping bleeding in combat wounds // Mezhdunarodnyj studencheskij nauchnyj vestnik. – 2023. – № 1. URL: https://eduherald.ru/ru/article/view?id=21190 (31.08.2023) (In Russ.).
2. Szul A.C., LB D. Walter Reed Army Medical Center Borden Institute //Emergency War Surgery: Third United States Revision. – 2004.
3. G ven H.E. Topical hemostatics for bleeding control in prehospital setting: Then and now //Turkish Journal of Trauma & Emergency Surgery/Ulusal Travma ve Acil Cerrahi Dergisi. – 2017. – Т. 23. – №. 5.
4. Lipatov V.A. Local hemostatics in surgery of the XXI century (literature review) / V.A. Lipatov, D.A. Severinov, A.R. Sahakyan // Innova. – 2019. — №1 (14) (In Russ.).
5. Mueller G. R. [et al.] A novel sponge-based wound stasis dressing to treat lethal noncompressible hemorrhage //Journal of Trauma and Acute Care Surgery. – 2012. – Т. 73. – №. 2. – С. S134–S139.
6. Katsumori T. [et al.] Uterine artery embolization using gelatin sponge particles alone for symptomatic uterine fibroids: midterm results //American Journal of Roentgenology. – 2002. – Т. 178. – №. 1. – С. 135–139.
7. de Castro K.C. [et al.] Pluronic® triblock copolymer-based nanoformulations for cancer therapy: A 10-year overview // Journal of Controlled Release. – 2023. – Т. 353. – С. 802–822.
8. Chen X. [et al.] Iota carrageenan gold-silver NPs photothermal hydrogel for tumor postsurgical anti-recurrence and wound healing //Carbohydrate Polymers. – 2022. – Т. 298. – С. 120123.
9. S. Braun, 4.431 – Encapsulation of Cells (Cellular Delivery) Using Sol-Gel Systems, Comprehensive Biomaterials. Elsevier, 2011, Pages 529-543. URL: https://doi.org/10.1016/B978-0-08-055294-1.00141-0 (28.08.2023).
10. Winkler B. [et al.] Effects of the novel polymer gel LeGoo on human internal thoracic arteries // The Annals of thoracic surgery. – 2011. – Т. 92. – №. 6. – С. 2235–2239.
11. Kretz B. [et al.] First results of clampless distal anastomosis in peripheral vascular bypass with LeGoo, a thermoreversible polymer //Journal of vascular surgery. – 2012. – Т. 55. – №. 6. – С. 1821–1825.