Background.

Пока в ряде национальных и европейских законодательств все чаще встает вопрос о сокращении, усовершенствовании и замене экспериментов с использованием животных, а также о переходе к исследованиям на основании компромиссных подходов, каждодневный труд лабораторий, занимающихся контролем качества лекарственных средств, тем не менее, сводится к работе и манипуляциям именно с лабораторными животными. Проведение исследований с использованием лабораторных животных имеет ряд преимуществ. Мыши, крысы и кролики являются млекопитающими, как и человек, их физиология схожа с человеческой и детально изучена. Идеальными испытуемыми их делает еще и относительно невысокая стоимость при закупке, компактность размеров (отсутствие неудобств при содержании в одной клетке нескольких особей) и быстрая размножаемость. Именно поэтому деятельность персонала лабораторий, проводящих исследования на животных, должна быть направлена на минимизацию негативных последствий при работе с ними, планирование оптимального эксперимента, выбор наименее травматичных для животных, но вместе с тем, эффективных манипуляций и их квалифицированное выполнение, при котором цели эксперимента достигаются наиболее гуманным способом.

Такие этические требования, как обеспечение максимального комфорта пребывания лабораторных животных в вивариях, предотвращение сильной боли при постановке эксперимента, а также доказанная целесообразность эксперимента, должны стать нравственной основой в обращении с ними. [1].

Для этих целей сотрудниками Курского филиала ФГБУ «ИМЦЭУАОСМП» Росздравнадзора была разработана стандартная операционная процедура (СОП) «Порядок гуманного обращения с лабораторными животными. Биоэтика лабораторных исследований». Документ базируется на ряде нормативно-правовых стандартов и предлагает ряд решений для минимизации возникновения болезненности и стресса у лабораторных животных при экспериментальных манипуляциях. С основными положениями СОП был ознакомлен соответствующий персонал, задействованный при работе с животными.

«Экологическое обогащение» как форма содержания лабораторных животных в условиях вивария, отвечающая нормам биоэтики

Немаловажный аспект при снижении стресс-фактора манипуляций с лабораторными животными – создание обогащенной среды. Термин «обогащенная среда» означает создание условий содержания с разного рода дополнениями, призванными повысить уровень благополучия животных. Экологическое обогащение (ecological enrichment) (ЕЕ) – это форма содержания, которая обеспечивает наличие двигательной, сенсорной и социальной стимуляции по сравнению со стандартными условиями содержания грызунов.

В условиях вивария, где все манипуляции, производимые с животными четко и строго регламентированы и закреплены стандартными операционными процедурами и рабочими инструкциями, не просто в полной мере воплотить все требования, относящиеся к ecological enrichment (ЕЕ). Одним из доступных и малозатратных факторов обогащения среды для крыс и мышей является поглаживание в клетке, дорсальный контакт, стандартная, проверенная процедура «щекотки» крыс. Оказывается, крысы и мыши любят, когда человек им слегка массирует спину и бока движением напоминающими «щекотку». Исследования в области поведенческой нейробиологии показали, что такая «щекотка» имитирует игру с сородичами и снижает стресс животных от взятия в руки и других неприятных лабораторных манипуляций, например, инъекций [2]. Такая полезная и несложная процедура активно используется при проведении разного рода манипуляций с животными в условиях фармакологической лаборатории Курского филиала.

Среда обитания животных в виварии Курского филиала организована таким образом, чтобы позволить животным реализовывать свое естественное поведение. Для грызунов (мышей) используется подстил, позволяющий «формировать норы» из материала для того, чтобы иметь возможность грызть (стружка обеспыленная из древесины хвойных или гипоаллергенных лиственных пород). Животные содержатся устойчивыми, гармоничными группами по 10 голов в клетке. Это предотвращает разрушение социальных групп и проявление агрессии.

Среда обитания, шумы, запахи, редкие или внезапные контакты с человеком, скука – все эти факторы могут стать источником дополнительного дистресса для животных. Например, мыши очень чувствительны к высокочастотным звукам (ультразвуку). Именно поэтому работа с животными и их содержание организованы таким образом, что данные негативные для животных проявления сведены к минимуму. В фармакологической лаборатории Курского филиала избегаются шумные манипуляции в местах содержания животных. Электронное оборудование, которое может издавать такие звуки вынесено за пределы боксов для содержания животных.

Запахи, мочевые метки играют большую роль в социальном поведении животных. Как отсутствие запахов в подстилке, так и присутствие запаха мочи и фекалий может усиливать агрессию. Поэтому в виварии фармакологической лаборатории Курского филиала мойка, дезинфекция и смена подстилочного материала производится обученным персоналом с такой частотой, чтобы с одной стороны удалять избыточные запахи отходов жизнедеятельности животных, а с другой стороны сохранить специфические запахи (метки), оставляемые животными [3].

Соблюдение биоэтических принципов на этапе подготовки лабораторных животных к испытанию

При подготовке к эксперименту в фармакологической лаборатории животные, находящиеся в боксах содержания, проходят процедуру ограничения потребления корма и воды. Ограничение потребления корма обычно связано с необходимостью голодной диеты перед введением испытуемых образцов, проведением хирургических операций, особенно полостных. Для грызунов допустимо лишение корма на 12 часов (испытания на биологическую активность), при испытании на аномальную токсичность – 2 часа, для кроликов при тесте на пирогенность – 18 часов.

Ограничение корма более 12 часов, а также лишение доступа к воде нежелательно, требует веского обоснования и в любом случае не должно превышать 24 часа.

Ограничение подвижности животного, или фиксация, может оказать большее стрессовое воздействие на животное, нежели экспериментальная процедура сама по себе, особенно для животных, которые к этому не приучены. В фармакологической лаборатории Курского филиала применяется мануальная или механическая фиксация. Мануальная фиксация – это ограничение подвижности животного руками, без применения каких-либо ограничивающих подвижность приспособлений: рестрейнеров, цилиндров и т.д. Такой способ фиксации может быть применен как для мышей, так и для кроликов, так как ласковый контакт с руками может успокаивающе действовать на животное.

При ограничении подвижности животных для минимизации стресса и нежелательных эффектов в фармакологической лаборатории Курского филиала сотрудники придерживаются следующих биоэтических принципов: предпочтительнее метод фиксации, доставляющий меньше дискомфорта животному; предварительное постепенное приучение животного к фиксатору (например, прежде чем начинать работу с кроликами, дать ему несколько раз спокойно посидеть в фиксаторе, сначала открытом, потом закрытом); при фиксации руками сотрудник держит животное крепко, но нежно, не применяя чрезмерную силу. В фармакологической лаборатории Курского филиала используются специализированные для каждого вида животных фиксаторы с регулирующимися разборными корпусами, для того, чтобы подстроить его под размер животного. Пластиковые цилиндры, применяемые для фиксации мышей, имеют разный диаметр – чем крупнее особь, тем большего диаметра используется фиксатор. Кроме того, фиксаторы для грызунов и кроликов можно «подгонять» по длине тела. Категорически не допускается содержание животного в фиксаторе дольше, чем это необходимо для проведения экспериментальной манипуляции, а также нахождение животного в фиксаторе без присмотра персонала лаборатории [4].

Реализация требований по гуманному обращению с животными на этапе проведения испытаний

При введении животным экспериментальных веществ любым путем, цель сотрудников фармакологической лаборатории – добиться наилучшего исполнения процедуры, чтобы возможными ошибками исполнения техники введения не причинить животному излишние страдания или даже смерть.

Режим и путь введения веществ определяются задачами эксперимента, видом животных, возможными эффектами конкретного способа введения и подробно описаны в фармакологической статье. Эти факторы также влияют на выбор техники выполнения процедуры и места инъекции. Некоторые пути введения веществ очень стрессуют животных, поэтому предпочтения отдаются наименее инвазивным и простым для исполнения техникам. Если в нормативной документации нет особых указаний, то сотрудники фармакологической лаборатории выполняют предписания соответствующей фармакопейной статьи.

При неправильном введении последствия могут быть очень серьезными, для этого в фармакологической лаборатории Курского филиала сотрудники придерживаются следующих правил:

• необходимо знать анатомию животного, например, строение суставов для внутрисуставных введений, длину пищевода для перорального введения веществ зондом, места прохождения нервов при внутримышечных инъекциях;
• использовать индивидуальные, новые, стерильные, апирогенные иглы перед введением разным животным; игла должна быть исправной и острой;
• игла вводится в ткани или сосуды уверенно, но мягко, далее следует плавно давить на поршень;
• после внутривенного введения сотрудник зажимает сосуд ватой и держит, пока кровь не свернется;
• недопустимо введение больших, нефизиологичных объемов экспериментальных веществ;
• для каждого пути введения следует выбрать подходящий размер иглы (введение больших по диаметру игл может быть болезненным и причинять ненужную боль и травмирование тканей);
• при многократном внутривенном введении препарата предусматривается возможность катетеризации вен у животных;
• перед введением испытуемого образца место инъекции животного освобождается от шерсти состриганием или сбриванием для эффективной обработки его антисептиком (например, спирт этиловый 70%);
• вводимый испытуемый раствор должен быть нагрет до температуры 37,0±2°C для предотвращения дискомфорта и шока [1].

Физико-химические свойства веществ и растворителей могут так же оказывать неблагоприятное воздействие на экспериментальных животных. Особенности исследуемых образцов (состав, растворимость, вязкость, pH, биологическая совместимость, чистота, стабильность) необходимо учитывать для снижения стресса и нежелательных эффектов после введения. Вещество может вызывать раздражение или изъязвление кожи. Поэтому всегда предварительно необходимо изучать имеющуюся инструкцию и учитывать рекомендации по введению (например, метод «двух игл»). pH растворов для введения должен быть максимально приближен к нейтральному (7,0). (Waynforth and Flecknell (1992). Толерантность к pH уменьшается в следующей последовательности для различных путей введения веществ: перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно. Раздражающие свойства веществ зависят не только от pH, но и от концентрации.

Плохо растворимое вещество может образовывать в растворе большие частицы, либо выпадать в осадок. Введение такого раствора внутримышечно может быть очень болезненным, а наличие частиц может закупоривать просвет иглы. Необходимо использовать стабильные биодоступные растворы. Для решения этой задачи в фармакологической лаборатории Курского филиала используется ультразвуковая ванна «Сапфир» УЗВ-2,8 ТТЦ. Вещества, обладающие высокой вязкостью, сложно вводить – для их введения требуется больший размер иглы.

Контаминированные вещества могут стать причиной инфицирования и раздражения места инъекции. Все вещества, вводимые животным, должны быть стерильными. В фармакологической лаборатории Курского филиала соблюдаются правила асептики при введении экспериментальных веществ.

Гуманное завершение испытания, биоэтические принципы эвтаназии

Принципы гуманности должны лежать в основе любых манипуляций с использованием лабораторных животных, в том числе, умерщвления после окончания испытаний. В тех случаях, когда экспериментальное воздействие причиняет животному боль и дистресс, которые нельзя устранить или уменьшить, необходимо определить критерии, когда все данные уже собраны и нет необходимости продолжать страдания животного. При обнаружении таких критериев животных следует подвергнуть эвтаназии (если эксперимент предполагает смерть животного). Однако современные международные стандарты рекомендуют даже для таких исследований использовать эвтаназию по достижению животным агонизирующего состояния, а не дожидаться, пока животное умрет самостоятельно.

Под эвтаназией понимают гуманное умерщвление животного, причиняющее минимальное количество боли, страха и дистресса. Способ должен быть безболезненным, не вызывать волнения у животного, минимализировать испуг (страх) и физиологический стресс, соответствовать возрасту, виду, состоянию здоровья животного, требовать минимального обездвиживания животного (фиксации), вызывать быструю потерю сознания и смерть, быть надежным, необратимым, легким в исполнении (желательно в малых дозах), безопасным и, по возможности, эстетически приемлемым для персонала, проводящего процедуру [5].

В фармакологической лаборатории Курского филиала «ИМЦЭУАОСМП» Росздравнадзора эвтаназия лабораторных животных осуществляется специализированной установкой «AE0904» с использованием ингаляции двуокисью углерода и соответствует биоэтическим принципам.

Conclusion.

Методы, исключающие испытания на лабораторных животных, играют важную роль в биомедицинских исследованиях, но на современном этапе развития биотехнологий не могут полноценно заменить такие испытания. Методы in vitro и компьютерное моделирование дополняют данные, полученные при экспериментах на животных. Реальной альтернативой неполного исключения испытаний на животных является сокращение количества подопытных, когда это не вредит сути и достоверности полученных результатов. Так как полный отказ невозможен, долг каждого участника при работе с лабораторными животными на всех этапах – совершенствование методологии. В случаях, если это не противоречит сути эксперимента, необходимо применять фармацевтические средства для облегчения боли и дистресса – анестетики, анальгетики, противовоспалительные, антибиотики, седативные препараты. Всегда, когда это не противоречит сути испытания, следует выбирать такие экспериментальные процедуры (отбор крови, инъекции и т.д.), которые предполагают наименьшую инвазивность, болезненность и стресс, а также способные уменьшить количество болезненных процедур, например, катетеризацию сосудов при испытании на биологическую активность и частых отборах крови и другие вспомогательные методы.

1. University Commission for the Control of the Maintenance and Use of Laboratory Animals. Guidelines for working with laboratory animals for employees of the State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education N.I. Pirogov of the Ministry of Health of Russia. – URL: http://net.knigi-x.ru/24meditsina/436800-1-universitetskaya-komissiya-kontrolyu-soderzhaniem-ispolzovaniemlaboratornih-zhivotnih-rukovodstvo-rabot.php. – Moscow, 2015 (Accessed: 26.11.2021). (in Russian).
2. Changing Human Behavior to Improve Animal Welfare: A Longitudinal Investigation of Training Laboratory Animal Personnel about Heterospecific Play or “Rat Tickling” / Megan R. LaFollette, Sylvie Cloutier, Colleen M. Brady, Marguerite E. O’Haire, and Brianna N . Gaskill // Animals. – 2020. – No. 10. – 1435 p. DOI: 10.3390 / ani10081435.
3. Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals. – Washing-ton (DC): National Academies Press (US). – 2008.
4. Institutional Commission for the Control of the Maintenance and Use of Laboratory Animals. Guidelines for working with animals for the staff of the IBCh RAS. – Institution of the Russian Academy of Sciences Institute of Bioorganic Chemistry. Academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikova. – URL: http://kniga.seluk.ru/k-himiya/880376-1-institutskaya-komissiya-kontrolyu-soderzhaniem-ispolzovaniemlaboratornih-zhivotnih-rukovodstvo-rabote-zhivotnimi-d.php. (in Russian).
5. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. // Laboratory Animals. – 1997. – No.31. – R. 1-32.