Background.

В настоящее время ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Мин здрава России (НМИЦ) осуществляет деятельность по образовательным, научным, клиническим направлениям и организационно-методическую работу с регионами. Научная деятельность НМИЦ выполняется в соответствии с распоряжением Правительства Российской Федерации от 31.12.2020 № 3684-р «Об утверждении Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 гг.)». Научные подразделения НМИЦ включают в себя семь научных отделов, девять научных отделений, шесть научных лабораторий, виварий. НМИЦ обладает необходимыми кадровыми и материальными ресурсами для проведения научных исследований не только национального, но и международного уровня. Помимо бюджетного финансирования в рамках государственного задания на выполнение прикладных научных исследований, изысканий и разработки НМИЦ ежегодно получают поддержку научных фондов в виде грантов, а часть научных работ выполняется по договорам с внешними заказчиками.

В 2023 году в НМИЦ реализуются восемь прикладных научных исследований в рамках государственного задания. На 2024–2026 гг. запланировано выполнение еще четырех проектов, поддержанных экспертами Российской академии наук. Количество разработанных тест-систем, медицинских изделий, лекарственных препаратов, доведенных до стадии клинических исследований, патентов на изобретение, полезную модель или промышленный образец, полученных в ходе исполнения государственного задания на выполнение прикладных научных исследований, является подтверждением успешного завершения научного проекта. Разработка медицинских изделий в НМИЦ производится по нескольким направлениям.

Разработка системы позиционирования и транспортировки больных со стола симулятора в процедурную брахитерапевтического аппарата

Современные достижения лучевой терапии позволили достигнуть существенного прогресса при лечении широкого круга злокачественных новообразований. Комбинированное лечение, включающее в себя химиолучевое лечение с облучением тазовых лимфоузлов, шейки и тела матки, параметрия с последующим дополнительным подведением дозы на шейку матки и резидуальные опухолевые очаги с помощью брахитерапии источниками высокой мощности дозы, рассматривается в качестве основного и наиболее эффективного лечения рака шейки матки II–III стадии. Внедрение современных технологий брахитерапии, включающих комбинацию внутрипросветной и внутритканевой брахитерапии и 3D-планирования на основе данных топометрической магнитно-резонансной томографии (МРТ), позволили существенно увеличить эффективность комбинированной терапии. Показатели безрецидивной и общей выживаемости оказались выше на 15–25% [1]. Неотъемлемым компонентом технологии 3D-брахитерапии является сохранение неизменной топографии опухоли и окружающих нормальных тканей при проведении топометрического исследования (КТ, МРТ) и лечебного сеанса. Для достижения этой цели существуют сложные автоматизированные приспособления, обеспечивающие перемещение пациента со стола симулятора на каталку или лечебный стол аппарата для проведения брахитерапии без изменения положения пациента. В связи с отсутствием регистрации и/или высокой стоимостью использование указанных приспособлений в Российской Федерации крайне ограничено, что препятствует широкому внедрению эффективных методов лечения больных раком шейки матки.

Сотрудниками научного отделения радиационной онкологии и ядерной медицины НМИЦ совместно с сотрудниками отечественной компании ООО «Ортотерапия» выполняется создание системы позиционирования и транспортировки больных со стола симулятора в процедурную брахитерапевтического аппарата. Изготовлены макеты оборудования, опытный образец – в производстве.

Разработка лекарственных препаратов на основе соматических клеток

В настоящее время в научном отделе онкоиммунологии НМИЦ ведутся работы по подготовке к регистрации лекарственных препаратов на основе соматических клеток:

1) аутологичная дендритно-клеточная вакцина на основе раково-тестикулярных антигенов (СaTeVac);

2) генотерапевтический препарат, содержащий T-клетки с CD19+CD45+ маркерами (T-CAR-19).

В рамках реализации государственного задания на выполнение прикладных научных исследований на 2024–2026 гг. «Разработка инновационных аутологичных лекарственных препаратов на основе соматических клеток, соответствующих индивидуальному иммуногенетическому профилю пациента, для лечения злокачественных опухолей с агрессивным течением», будет создан инновационный аутологичный отечественный клеточный продукт на основе соматических клеток человека, предназначенный для лечения солидных опухолей, в первую очередь – мало чувствительных к иммунотерапии, в том числе у детей. Применение продукта предполагается на первом этапе у больных саркомами мягких тканей. В последующем продукт может быть назначен для лечения меланомы, рака почки, первичных опухолей центральной нервной системы (ЦНС), злокачественных солидных опухолей с исчерпанными возможностями стандартной терапии. Предполагается использование продукта для вторичной и третичной профилактики злокачественных опухолей.

Лекарственный препарат на основе соматических клеток «СaTeVac» нетоксичен и безопасен для применения. Механизм действия заключается в генерации специфического клеточно-опосредованного иммунного ответа на опухолевые антигены, представленные дендритной клеткой (ДК), вследствие чего реализуется противоопухолевый эффект.

Дизайн проекта предполагает на начальном этапе разработку программы доклинических исследований и протоколов производства гомологичных клеточных продуктов разных видов экспериментальных животных, определение показателей качества и стабильности в условиях эксперимента вакцинных ДК (идентичность (подлинность), специфическая активность, жизнеспособность и др.).

Изучение механизма действия лекарственного препарата на основе зрелых ДК будет проведено с применением персонализированных клеточных систем in vitro (2D-модели, включающие аутологичные опухолевые клетки и T-лимфоциты, генерированные в присутствии ДК, в аналитической системе xСelligence®; миграционная активность вакцинных ДК в системе прижизненного наблюдения Сell-IQ; изучение секреции цитокинов и цитолитических белков с помощью метода мультиплексного анализа (Bio-Plex system, «Bio-Rad», США); анализ цитотоксического эффекта клонов T-лимфоцитов, специфичных к антигенам опухолевых клеток и T-клеток памяти с использованием метода проточной цитометрии [2]).

Изучение интеграции эффекторных клеток в тумороид после их взаимодействия с вакцинными ДК, с определением их характеристик, будет выполнено на трехмерных моделях опухоли. Планируется получение аутологичных сфероидов из опухолевых клеточных культур (меланома кожи, саркомы, глиобластомы) для последующей оценки характеристик. Затем будет осуществлена наработка опытных партий гомологичного клеточного продукта на основе ДК разных видов экспериментальных животных, определение параметров качества и стабильности в условиях эксперимента, исследование острой токсичности дендритно-клеточной вакцины с оценкой местно-раздражающего действия при внутрикожном введении лабораторным животным (мыши Balb/C, n=50). Изучение хронической токсичности, в т.ч. иммунотоксичности дендритно-клеточной вакцины с оценкой местно-раздражающего действия при внутрикожном введении запланировано на гомологичных моделях ДК крысы, нагруженных опухолевым лизатом (крысы линии Wistar, n=250, самки, самцы). Анализ токсичности будет проведен на аутбредных крысах и мышах с введением дендритно-клеточной вакцины в максимальных дозах (18 млн клеток/кг у мышей и 9 млн клеток/кг у крыс, что составляет 10-кратную терапевтическую дозу. Изучение фармакодинамики с использованием гомологичного клеточного продукта на основе зрелых ДК разных видов экспериментальных животных будет оценено:

1) с использованием перевивной животной модели веретеноклеточной саркомы мышей BALB/C (n=100), полученной раннее (свидетельство о депонировании 165 МSarFE от 22.12.2021 г. Коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН);

2) с использованием перевивной животной модели меланомы В16 мышей C57BL/6 (n=100);

3) с использованием животной модели глиобластомы С6 крысы (n=50) и др. Все лабораторные исследования будут осуществляться в соответствии c правилами Европейской Конвенции о защите позвоночных животных (СДСЕ № 123) и в соответствии с нормами биоэтики (CIOMS and ICLAS, 2012). Исследование одобрено Локальным Комитетом по Этике ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (Выписка № 03/23 из протокола № 03 от 16.02.2023).

В рамках выполнения работ по созданию клеточного препарата, улучшающего функциональную активность эффекторных Т-лимфоцитов, осуществляется оптимизация технологии и получения полноценных прототипов лекарственного препарата «T-CAR 19», оценка ключевых параметров и их вариативности, разработка технологических процессов производства клеточного продукта «T-CAR-19», анализ его стабильности.

Разработка новых диагностических и лечебных субклеточных технологий

В научной лаборатории субклеточных технологий с группой онкоэндокринологии НМИЦ проводятся исследования по двум, отчасти пересекающимся, направлениям. Первое соответствует названию лаборатории – это исследование субклеточных компонентов плазмы и других биологических жидкостей с конечной целью создания новых диагностических и лечебных технологий. Так, в рамках этой работы созданы несколько оригинальных, простых и экономичных методов выделения внеклеточных мембранных нановезикул (ВНВ) из плазмы. На основе этих сугубо технологических разработок были созданы методы диагностики и/или оценки степени тяжести ряда онкологических заболеваний: колоректального рака, лимфомы Ходжкина, аденокарциномы желудка [3, 4]. В основе перечисленных методов лежат технологии количественного анализа (или подсчета) циркулирующих в плазме ВНВ с определенными биохимическими характеристиками. Полученные результаты подтвердили, что эти характеристики имеют высокий диагностический потенциал, а разработанные технологии могут быть использованы для его реализации. В настоящее время ведется работа с целью создания прототипа диагностической тест-системы на основе AuNP-аптасенсора.

Кроме возможностей количественного анализа, разработанные методы позволяют физически выделять отдельные везикулярные популяции и проводить биохимический анализ их состава. Например, было показано, что в составе плазмы присутствуют ВНВ, мембрана которых содержит маркеры тканевой дифференциации. Такие везикулы секретируются клетками соответствующих тканей, а их биохимический состав отражает состояние этих тканей. С учетом данного феномена была разработана технология выделения специфических популяций ВНВ плазмы на основе суперпарамагнитных микрочастиц и ДНК-аптамеров, а в качестве наиболее информативного компонента таких ВНВ были выбраны молекулы малых регуляторных РНК, микроРНК. Диагностический потенциал методов анализа везикулярных микроРНК был оценен на примере решения задачи дифференциальной диагностики узловых образований щитовидной железы и оценки степени риска прогрессии рака предстательной железы [5–7]. Так, создание и применение методов анализа микроРНК является вторым направлением работы коллектива лаборатории. В настоящее время ведутся исследования с целью оптимизации аналитических технологий и поиску путей их коммерциализации.

Анализ микроРНК может быть информативным не только в составе специфических популяций ВНВ плазмы, но и в составе биопсийного материала. Особенно полезны технологии анализа микроРНК могут быть в тех ситуациях, когда нет возможности проведения полноценного гистологического исследования, и клинически значимые выводы делаются на основе анализа материала клеточных соскобов, мазков, тонкоигольных аспирационных биопсий, т.е. исследований, не сохраняющих структуру ткани и позволяющих проводить только цитологический анализ. Например, анализ нескольких молекул микроРНК позволяет определить степень тяжести цервикальной дисплазии, или риск злокачественной природы узловых образований щитовидной железы, или очаговых образований поджелудочной железы [8,9]. Эти разработки являются наиболее «продвинутыми» в плане практической реализации, и в настоящее время ведется работа по оптимизации разработанных технологий под отечественных производителей аналитического оборудования и расходных материалов.

Conclusion.

Таким образом, сосредоточение работы научных лабораторий на создании продуктов для практического применения в онкологии (в том числе диагностических тест-систем, технологий в области молекулярной генетики) является приоритетным в организации и планировании научно-исследовательской работы НМИЦ. Объединяя совместные усилия, активно взаимодействуя с научно-исследовательскими подразделениями учреждений, подведомственных Министерству здравоохранения Российской Федерации, отечественными производителями медицинского оборудования позволяют НМИЦ активно разрабатывать и внедрять в клиническую практику отечественные медицинские изделия и диагностические тест-системы.

1. Poёtter R. MRI-guided adaptive brachytherapy in locally advanced cervical cancer (EMBRACE-I): a multicentre prospective cohort study / Poёtter R., Tanderup K., Schmid M. [et al.] // Lancet Oncol. – 2021. – Vol. 22(4). – p. 538–547.
2. Нехаева Т.Л. Изучение особенностей миграции дендритных клеток в экспериментальной аналитической системе CELL-IQ / Нехаева Т.Л., Данилова А.Б., Балдуева И.А. // Сибирский онкологический журнал. – 2018. – Том 17(4). – с. 14–23.
3. Nazarova I. Evaluation of Colon-Specific Plasma Nanovesicles as New Markers of Colorectal Cancer / Nazarova I., Slyusarenko M., Sidina E. [et al.] // Cancers (Basel). – 2021. – Vol. 13(15). – p. 3905.
4. Slyusarenko M. AuNP Aptasensor for Hodgkin Lymphoma Monitoring / Slyusarenko M., Shalaev S., Valitova A. [et al.] // Biosensors (Basel). – 2022. – Vol. 12(1). – p. 23.
5. Zabegina L. Analysis of miRNAs in the PSMA-positive fraction of plasma nano-sized extracellular vesicles in patients with prostate cancer / Zabegina L.M., Nikiforova N.S., Nazarova I.V. [et al.] // Cancer Urol. – 2022. – Vol.17(4). – p. 65–75.
6. Zabegina L. MiRNA let-7 from TPO(+) Extracellular Vesicles is a Potential Marker for a Differential Diagnosis of Follicular Thyroid Nodules / Zabegina L., Nazarova I., Knyazeva M. [et al.] // Cells. – 2020. – Vol. 9(8). – p. 1917.
7. Zabegina L. A New Approach for Prostate Cancer Diagnosis by miRNA Profiling of Prostate-Derived Plasma Small Extracellular Vesicles / Zabegina L., Nazarova I., Nikiforova N. [et al.] // Cells. – 2021. – Vol. 10(9). – p. 2372.
8. Kniazeva M. NOVAprep-miR-Cervix: New Method for Evaluation of Cervical Dysplasia Severity Based on Analysis of Six miRNAs / Kniazeva M., Zabegina L., Shalaev A. [et al.] // Int J Mol Sci. – 2023. – Vol. 24(11). – p. 9114.
9. Knyazeva M. Reciprocal Dysregulation of MiR-146b and MiR-451 Contributes in Malignant Phenotype of Follicular Thyroid Tumor / Knyazeva M., Korobkina E., Karizky A. [et al.] // Int J Mol Sci. – 2020. – Vol. 21(17). – p. 5950.