Background.

В современной фармацевтической промышленности в качестве действующих и вспомогательных веществ используются разнообразные природные, синтетические и полусинтетические полимеры [1].

Биологическую активность, клиническую эффективность, безопасность, функциональную пригодность полимерных компонентов зачастую характеризуют молекулярной массой. Для полимера молекулярная масса является среднестатистической величиной, определяется типом молекулярно-массового распределения (ММР) и способом усреднения. Показатели, связанные с оценкой молекулярной массы и ее распределением, нормируются. Нормы приведены в общих фармакопейных статьях и фармакопейных статьях национальных фармакопей или же в нормативных документах предприятий. ММР может относиться и к показателям, характеризующим чистоту препарата, и к характеристикам подлинности и качества самого действующего вещества [2–4].

Теоретические особенности метода эксклюзионной хроматографии

Наиболее распространенным для определения ММР полимеров является метод эксклюзионной хроматографии (ЭХ). В зависимости от природы элюента различают гель-проникающую хроматографию (элюент – органический растворитель) и гель-фильтрационную хроматографию (элюент – вода), однако обобщающий термин «эксклюзионная» (от англ. «size exclusion» – исключение по размеру) наиболее четко определяет сущность процесса.

Теория процесса ЭХ достаточна сложна. Согласно представлениям1 изменение параметров взаимодействия в системе «полимер – сорбент – растворитель» может приводить к переходу от адсорбционного механизма к эксклюзионному и наоборот. По этой причине в ЭХ, как правило, сорбент и состав элюента подбирают таким образом, чтобы исключить или максимально уменьшить энергию адсорбционного взаимодействия2.

Связь между удерживаемым объемом VR и молекулярной массой М (размером молекул) образца описывается калибровочной кривой. Каждый сорбент характеризуется своей калибровочной кривой, по которой легко оценить область разделяемых на нем молекулярных масс.

Точка А соответствует пределу эксклюзии, все молекулы, масса которых больше, чем в точке А, будут элюироваться одним пиком с удерживаемым объемом Vо. Точка В отражает предел проникания, и все молекулы, масса которых меньше, чем в точке В, также будут выходить из колонки одним пиком с удерживаемым объемом Vt. Между точками А и В располагается диапазон селективного разделения. Отрезок CD представляет собой линейный участок калибровочной кривой (рисунок). Этот участок описывается уравнением VR = C1 – C2lgM. Величину С2 называют разделительной емкостью колонки, чем она больше, тем селективнее разделение в данном диапазоне масс. В нелинейных областях калибровочной кривой эффективность фракционирования снижается и существенно усложняется обработка данных, снижается точность результатов. Если какое-либо вещество элюируется с удерживаемым объемом больше Vt, это указывает на проявление других механизмов разделения (как правило, адсорбционного). Адсорбционные и другие побочные эффекты негативно сказываются на исследовании ММР полимеров, существенно искажая результаты анализа2 [5].

Оборудование и системы обработки данных для определения ММР

Оборудование для ЭХ принципиально ничем не отличается от того, которое используют в других видах высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), однако эксплуатационные характеристики аппаратуры значительно влияют на точность получаемых результатов. В ЭХ предъявляются жесткие требования к стабильности потока подвижной фазы, точности термостатирования, минимизации мертвых объемов3. Для работы с агрессивными по отношению к традиционно используемым капиллярам и фитингам подвижными фазами требуется комплектация системы специальными дегазатором, насосами и автодозатором, компоненты которых устойчивы к растворителям, для обеспечения надежности анализа биополимеров должны использоваться биоинертные материалы4.

Особую роль в успешном анализе методом ЭХ играют расходные материалы и оборудование для пробоподготовки4. Для разделения макромолекул в широком диапазоне молекулярных масс (от 102 до 108 Да) в хроматографических системах могут применяться либо несколько колонок с различными размерами пор, либо одна «линейная» колонка с биили тримодальным распределением пор по размерам3.

Для детектирования разделенных по молекулярной массе компонентов используется как минимум один концентрационный детектор (традиционные для ВЭЖХ рефрактометрический и спектрофотометрический, детектор по испарительному светорассеянию), а также специальные детекторы для анализа полимеров: вискозиметрический, разнообразные детекторы для статического и динамического светорассеяния, оптимизированные для решения конкретных прикладных задач. Возможность применения того или иного детектора определяется особенностями объектов исследования. Так, например, в современных приборах детектор многоуглового рассеяния света позволяет определять абсолютную средневесовую молекулярную массу (ММ) полимера. Однако к изучению разветвленных макромолекулярных структур следует подходить с осторожностью, поскольку корректность применения этой методологии пока не доказана [5]. Для исследования разветвленных макромолекул может быть использован вискозиметрический детектор с расчетом ММР по универсальной калибровочной зависимости Бенуа. При работе с дифференциальным рефрактометром следует помнить, что в определенном диапазоне масс его сигнал зависит от молекулярной массы полимера. При исследовании полимеров, содержащих значительное количество низкомолекулярных фракций, в процессе обработки результатов необходимо введение соответствующих поправок или проведение калибровки детектора3. Современные производители оборудования, как правило, предлагают мультидетекторные системы для ЭХ с возможностью выбора комплектации детекторов. Детекторы для ЭХ и их сочетания позволяют определять абсолютную молекулярную массу, конформацию макромолекул в растворе, радиус инерции, гидродинамический радиус, степень разветвленности, константы уравнения МаркаКуна-Хаувинка, вириальные коэффициенты4.

В методе ЭХ особые требования предъявляются к системам обработки данных3. Отмечается, что в зависимости от производителя, программное обеспечение, используемое для расчетов ММР, имеет разный подход и набор опций для построения и оптимизации калибровки, и этот факт сказывается на возможности адекватного воспроизведения методики [6].

Определенные сложности применения ЭХ имеются в анализе сополимеров, особенно композиционно-неоднородных, это связано с дополнительным трудоемким поиском элюирующих систем [5].

Несмотря на указанные особенности, метод ЭХ стал доступным, легким, простым и широко используемым методом определения ММР полимеров.

Особенности исследования молекулярных параметров полимеров различных типов и их практическая значимость

Показатель ММР в препаратах полисахаридов, используемых в качестве кровезаменителей, например, на основе гидроксиэтилированных крахмалов (ГЭК) и декстранов, является одной из важнейших характеристик, так как определяет их фармацевтические свойства. Например, эффективно блокировать потерю альбумина и жидкости из внутрисосудистого пространства в участках повышенной проницаемости стенок капилляров способны только фракции ГЭК с ММ 60–350 кД [7]. ГЭК и декстраны являются полимерами, в которых ММР обусловлено особенностями их синтеза и очистки5.

Анализ ГЭК методом ЭХ с использованием мультидетекторной системы (рефрактометрический детектор и детектор многоуглового рассеяния света) предложен в работе6. Расчет ММР проведен с помощью программного обеспечения PSS WinGPC Unity optional: Compliance Pack.

В работе [6] подробно освещены методические особенности определения ММР декстранов. Авторы отмечают необходимость включения в раздел методик с описанием способов расчета ММР максимально полной информации: использованного хроматографического оборудования, колонок, программного обеспечения, стандартных образцов (их производителей, названий, каталожных номеров); состава и методики приготовления подвижной фазы, стандартных образцов, испытуемых растворов; условий хроматографирования, не допускающих указания ориентировочных интервалов; параметров пригодности хроматографической системы; описание процедуры калибровочной зависимости, параметров пригодности калибровки; описание расчета ММР.

Свои особенности имеет определение ММР в препаратах белков крови. В отличие от полисахаридов, белки обладают низкой полидисперсностью, так как имеют детерминированное значение ММ и формы молекул, полученные в процессе биосинтеза и посттрансляционной модификации [8]. Поэтому в качестве характеристики ММР белков используют содержание в препаратах их фрагментов, димеров, тримеров, полимеров, агрегатов и других комплексов олигомеров различного состава. Каждая из данных фракций обладает своими фармакокинетическими свойствами.

В работе [7] показана возможность разделения альбуминов методом ЭХ с использованием колонки ProteinPak 300SW, элюента 20 мМ фосфатного буфера с 3 мМ азидом натрия при pH 7,0. Использована система детекторов, включающая спектрофотометрический и детектор многоуглового лазерного рассеяния света. Определение ММР в препаратах альбумина различных производителей с использованием детектора многоуглового лазерного рассеяния света не требует применения стандартных образцов и позволяет напрямую провести расчет ММ и среднеквадратичных радиусов молекул для фракций, элюирующихся в мертвом объеме хроматографической колонки и определить их процентное содержание в препаратах.

Применение хроматографической системы с колонкой TSKgel G4000SWxl, 20 мМ фосфатного буфера с 3мМ азидом натрия, pH 7,0, двух детекторов (спектрофотометрического и многоуглового лазерного рассеяния света) позволило установить, что вариабельность аминокислотной последовательности иммуноглобулина не сказывается на значении коэффициента полидисперсности основных фракций препарата иммуноглобулина. В то же время при сопоставлении хроматограмм препаратов иммуноглобулина были выявлены качественные различия, которые зависели от производителя. Это указывает на возможность контроля качества препаратов иммуноглобулина и подтверждения их подлинности. Данные по ММ хроматографических фракций могут давать дополнительную информацию о процессах деградации белковых молекул, что делает целесообразным применение указанного метода при изучении стабильности белков [7].

ЭХ используется в качестве метода для исследования примесей с молекулярной массой, превышающей молекулярную массу инсулина7. Методы генной инженерии позволяют биофармацевтическим компаниям разрабатывать различные аналоги инсулина пролонгированного действия. В настоящее время фармакопейных методик для анализа инсулиновых аналогов не существует. Разработана методика идентификации оригинального инсулина и его биоаналогов с помощью ЭХ с применением колонки Agilent AdvanceBio SEC 130 размера 7,8 300 мм с размером частиц сорбента 2,7 мкм. Эффективность применения этой методики для повседневных анализов подтверждена с помощью испытаний пригодности системы, а также исследования воспроизводимости времени удерживания и площади пиков с использованием оригинального инсулина в качестве эталонного вещества. Также представлено применение этой колонки для количественного определения примесей с молекулярными массами больше, чем у инсулина7.

Метод ЭХ позволяет реализовать анализ вспомогательных веществ полимерной природы, используемых в фармацевтической промышленности. Описан опыт применения аналитической системы 1260 Infinity GPC/SEC Analysis System с рефрактометрическим детектором для исследования связующих веществ. При исследовании повидона использованы системы двух и трех колонок Agilent PLgel 10 мкм MIXED-B 300 7,5 мм; элюирование проводили 0,1%-ным раствором бромида лития в диметилформамиде (ДМФА)8.

Жидкостная хроматография в критических условиях (ЖХКУ) использована для изучения различий между химическим строением полиэтиленгликолей (ПЭГ), поскольку традиционные варианты хроматографии нечувствительны к небольшим изменениям в строении вещества. Критическая точка – это параметры элюента, которые способствуют балансу между ЭХ и адсорбционными механизмами взаимодействия так, что молекулы элюируются при одинаковом времени удерживания вне зависимости от ММ. В критической точке небольшие изменения в химической структуре, такие как тип концевой группы, могут стать причиной больших изменений в картине элюирования. Условия критической точки для ПЭГ были установлены путем анализа нескольких стандартов ПЭГ с узким молекулярно-массовым распределением и разной молекулярной массой с применением ацетонитрила и воды в разных изократических комбинациях. Разделение проводили на колонке Agilent PLRP-S 100 5 мкм, 150 4,6 мм. Использовали испарительный детектор светорассеяния9.

Колонки Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 8 мкм применены для анализа пектина методом ЭХ с целью установления ММР для прогноза его реологических свойств, являющихся критическими для применения пектина. Элюентом являлась смесь растворов 0,2 M нитрата натрия и 0,01 M дигидрофосфата натрия при pH 7. Разделение проводили с использованием системы для ЭХ PL-GPC 50 Integrated GPC/SEC System с рефрактометрическим детектором. Метод позволяет различать образцы пектинов по молекулярной массе и полидисперсности10.

Также ЭХ может использоваться как средство контроля качества для определения молекулярной массы и ММР хитозана. Проведен анализ трех типов хитозана в комплексной системе для ЭХ PL-GPC 50 Integrated GPC/SEC System с комплектом из двух колонок Agilent PL Аquagel-OH MIXED-H 8 мкм. Образцы хитозана растворяли в кислоте, затем анализировали в буферном растворе нитрата натрия 0,5М при низком значении pH. Система была откалибрована по стандартам полисахарида пуллулана с узким ММР. Использовался рефрактометрический детектор11 [9].

Аналогичная комплексная хроматографическая система с рефрактометрическим детектором применена для анализа метилцеллюлозы. Проведен анализ двух образцов метилцеллюлозы на колонках PL aquagel-OH 60 8 мкм, 300 7,5 мм и PL aquagel-OH 40 8 мкм, 300 7,5 мм. В качестве элюента использована смесь 0,05 M раствора дигидрофосфата натрия с 0,25 M раствором хлорида натрия при pH 7. Калибровка проводилась на стандартах полисахарида поллулана. Результаты исследования показали хорошую корреляцию между вязкостью и средними значениями молекулярной массы12.

Метод ЭХ применяется для анализа покрытий твердых дозированных лекарственных форм. Анализ желатина методом ЭХ дает информацию о молекулярной массе, от которой зависят физические свойства полимера. В эксперименте11 использовалась комплексная система для ЭХ PL-GPC 50 с рефрактометрическим детектором и двухугловым детектором светорассеяния, две колонки PL aquagel-OH MIXED-H 8 мкм, 300 7,5 мм. Элюент подготавливался как буферный раствор с отрегулированным рН путем добавления 0,1 M NaOH. Коэффициент преломления и данные о рассеянии света использовались для расчета молекулярной массы желатина.

Аналитическая система для ЭХ 1260 Infinity GPC/SEC Analysis System с рефрактометрическим детектором использована для анализа ацетата целлюлозы. Разделение проводили на комплекте из трех колонок PLgel 10 мкм MIXED-В, 300 7,5 мм. Элюентом служил 0,5% раствор бромида лития в диацетилацетамиде13.

Также ЭХ можно использовать для выявления небольших различий в профилях распределения молекул разных размеров в водорастворимых полимерах, имеющих одинаковый коэффициент вязкости14. Колонки Agilent PL aquagel-OH 40 8 мкм и PL aquagel-OH 60 8 мкм подходят для распознавания незначительного разброса значений молекулярной массы карбоксиметилцеллюлозы. Последовательное их соединение в системе позволяет охватить диапазон молекулярных масс от 104 до 107. Калибровка колонок проведена по стандартам пуллулана.

Поликапролактам, используемый для управляемого высвобождения лекарственных веществ в организме, успешно исследуется методом ЭХ. Разделение осуществляется с использованием системы PL-GPC 50 Integrated GPC/SEC System с комплектом колонок Agilent PLgel 5 мкм MIXED-C и рефрактометрическим детектором, элюентом является тетрагидрофуран15.

Анализ суспендирующих веществ и увеличивающих вязкость веществ, например, гидроксиэтилцеллюлозы (ГЭЦ), также можно проводить методом ЭХ. Для анализа ГЭЦ хорошо подходят колонки PLgel 5 мкм MIXED-C и элюент ДМФА с добавлением бромида лития или система колонок PL aquagel-OH 60 8 мкм, 300 7,5 мм и PL aquagel-OH 40 8 мкм, 300 7,5 мм и элюентом на водной основе – смеси 0,05 M раствора дигидрофосфата натрия и 0,25 M раствора при pH 7. Используется рефрактометрический детектор15.

Как показывают приведенные выше данные, несмотря на то, что ЭК – сравнительно быстрый и простой метод [10], результаты исследования по определению ММР могут сильно зависеть от большой совокупности факторов: подвижной фазы и стабильности потока, точности термостатирования, величин мертвых объемов, характеристик используемого стандарта, колонок, биоинертности контактирующих с биополимерами материалов, способа и точности калибровки, используемого для расчетов ММР программного обеспечения. Кроме того, для отдельных полимеров точность определения ММ может зависеть от источника природного сырья. Например, в производстве ГЭК используется крахмал картофельный или крахмал кукурузы восковой спелости [4], отличающиеся содержанием амилозы и амилопектина, фосфатов; вероятно различие в степени ветвления приводит к большей характеристической вязкости картофельного крахмала [11]. В данном и подобных случаях требование ОФС.1.2.1.2.0007.18 «Эксклюзионная хроматография» [2] о том, что «по возможности природа стандартного образца должна быть аналогичной природе испытуемого вещества», приобретает критическое значение и его следует понимать как «природа стандартного образца должна совпадать с природой испытуемого вещества».

Особого внимания требует переход от рекомендованных в нормативной документации параметров хроматографических систем исследования к аналогичным (с указанием конкретных количественных величин). В связи с этим, при определении ММ и ММР полимеров ОФС.1.2.1.2.0007.18 «Эксклюзионная хроматография» [2] требуется соответствие дополнительным критериям, связанным с оценкой пригодности калибровочной кривой. Как правило, для этих целей используется диапазон эксклюзии или предел эксклюзии.

Все вышеперечисленные факторы могут влиять на точность определения ММ методом ЭХ и должны учитываться при разработке и применении методик исследования.

Курский филиал ФГБУ «ИМЦЭУАОСМ» Росздравнадзора располагает современной хроматографической системой с диодно-матричным и рефрактометрическим детекторами, работающей в режиме ЭХ, и специализированным программным обеспечением, и имеет возможность проводить исследования широкого спектра лекарственных препаратов, предусматривающие определение ММР.

Conclusion.

Таким образом, многообразие возможных вариантов метода ЭХ позволяет определять молекулярные параметры веществ разной природы по их размеру в широком диапазоне молекулярных масс – от 102 до 108 Да, что делает его незаменимым в исследованиях синтетических и биополимеров, входящих в состав лекарственных препаратов, с целью определения ММР.

Богатый современный ассортимент хроматографических колонок, калибровочных стандартов, приборное оснащение и программное обеспечение различных производителей позволяет определять молекулярные параметры синтетических и биомолекулярных полимеров различных типов, включая варианты обычной ЭХ вплоть до сложных определений с использованием многоколоночных и многодетекционных методов.

______________________________________________________________________

1 Беленький Б.Г., Виленчик Л.З. Хроматография полимеров. – М.: Химия, 1978. – 344 с.

Нефедов П.П., Лавренко П.Н. Транспортные методы в аналитической химии полимеров. – Л.: Химия. Ленингр. отд., 1979. – 232 с.

2 Стыскин Е.Л. и др. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. – Химия, 1986. – 287 с.

3 Стыскин Е.Л. и др. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. – Химия, 1986. – 287 с.

4 URL: https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/5991-3651EN_LR.pdf.

5 Рафиков С.Р. и др. Методы определения молекулярных весов и полидисперсности высокомолекулярных соединений. – М.: Издательство академии наук СССР, 1963. – 335 с.

6 URL: https://www.pss-polymer.com/fileadmin/pdf/publication/Pharmeurope _Hydroxyethyl-Starch.pdf

7 URL: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-6872RU.pdf

8 URL: https://www.agilent.com/library/applications/5991-2519EN_ HPCpharma.pdf

9 URL: https://www.agilent.com/Library/applications/5990-8319EN.pdf

10 URL: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-5794EN.pdf

11 URL: https://www.agilent.com/library/applications/5991-2519EN_HPCpharma.pdf

12 URL: https://www.hplc.eu/Downloads/PLgels_Organic.pdf

13 URL: https://www.gimitec.com/file/5991-5809EN.pdf

14 URL: https://www.agilent.com/cs/library/applications/ApplicationCompendium_GPC_Food_5991-2029EN.pdf

15 URL: https://www.agilent.com/library/applications/5991-2519EN_HPCpharma.pdf

1. Nabiullina M.R. . Size-exclusion chromatography and electrophoresis method for determining the molecular weight distribution of products based on biopolymers // Razrabotka i registraciya lekarstvenny`x sredstv (Drug development & registration). – 2015. – Vol. 1. – №. 10. – P. 106–112. (in Russian).
2. State Pharmacopoeia of the Russian Federation. – XIV ed. – Vol. 1. – Moscow, 2018. (in Russian).
3. State Pharmacopoeia of the Republic of Belarus. Vol. 1 – Minsk, 2012. (in Russian).
4. European Pharmacopoeia, 8th edition: official text. – Council of Europe, 2013.
5. Chernikova E.V. [et al.] Special workshop on physical-chemical and physical-mechanical methods of polymer research. Part 1. Theory / Ed. corresponding member of RAS, prof. V.P. Shibaeva – Moscow, Moscow State University. M.V. Lomonosov, 2013. – 112 p. (in Russian).
6. Smirnov R.S. [et al.] Methodological aspects of determining molecular mass distribution of dextrans by size-exclusion chromatography for various groups of medicines // Vedomosti Nauchnogo centra e`kspertizy` sredstv medicinskogo primeneniya (Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products). – 2017. – Vol. 7. – № 1. – P. 3–8. (in Russian).
7. Flegontov P.A. The use of a multi-angle laser light scattering detector for the analysis of the composition and molecular weight distribution in drugs based on polysaccharides and blood proteins: dis. ... candidate of biological sciences: 03.01.04. National Medical Research Center for Hematology, 2014. (in Russian).
8. Schulz G. E., Schirmer R. H. Principles of protein structure. – Springer Science & Business Media, 2013.
9. Sreekumar S. [et al.] Parameters influencing the size of chitosan-TPP nano-and microparticles //Scientific reports. – 2018. – Т. 8. – №. 1. – С. 1-11.
10. Philo J.S. Is any measurement method optimal for all aggregate sizes and types? // The AAPS Journal. – 2006. – Vol. 8(3). – P. 564–571.
11. Sommermeyer K. Differences in chemical structures between waxy maize- and potato-starch-based hydroxyethyl starch volume therapeutics // Transfusion alternatives in transfusion medicine. – 2007. – Vol. 9, Is. 3. – P. 127–133.