Испытание in vitro (In Vitro Release Testing – IVRT) является важным методом для оценки качества лекарственных форм, особенно топических препаратов, таких как кремы, гели и мази. Этот метод позволяет оценить скорость высвобождения активного вещества из лекарственной формы и его проникновение через кожу. Данный метод, очевидно, нужно рассматривать как альтернативный подход для демонстрации биоэквивалентности (BE) лекарственных средств для местного применения.

В фармакопее Евразийского экономического союза (ЕАЭС) IVRT-тест используется для определения скорости и степени высвобождения активного компонента из лекарственной формы в условиях, максимально приближенных к физиологическим. IVRT возможно применить при разработке дженериков для местного применения в качестве общепринятого метода сравнения с продуктами брендов, а также для определения рабочих характеристик нескольких прототипов лекарственных препаратов в качестве инструмента скрининга.

IVRT служит ценным инструментом для демонстрации сравнительных показателей высвобождения лекарственных средств in vitro между тестируемыми и эталонными препаратами. IVRT не имеет эмпирической зависимости с биодоступностью или биоэквивалентностью in vivo и не может служить основанием для прогноза эффективности лекарственной формы. Однако скорость высвобождения действующего вещества является критическим показателем качества, который напрямую влияет на свойства лекарственной формы. Этот показатель следует указывать в спецификации на выпуск и на конец срока годности готового лекарственного препарата.

Тест IVRT основан на принципе диффузии через мембрану. Лекарственная форма помещается в донорный отсек, отделенный от принимающего отсека мембраной. Растворитель из донорного отсека диффундирует через мембрану в принимающий отсек, перенося растворенное лекарственное вещество (действующее вещество).

Скорость диффундирования растворенного вещества определяется первым законом Фика и зависит от площади поверхности диффузионной мембраны, разницы концентраций между двумя областями, расстояния, на которое происходит диффузия, температуры, вязкости растворителя, химической структуры молекул и свойств ДВ, строения и свойств мембраны. Гидрофобные мембраны имеют аффинность к гидрофобным веществам и отталкивают воду. Они пропускают газы и жидкости, которые не растворяются в воде, при этом задерживая воду и другие гидрофильные вещества.

С другой стороны, гидрофильные мембраны обладают аффинностью к воде и пропускают ее, одновременно задерживая гидрофобные вещества.

В тесте IVRT могут использоваться различные типы мембран, которые представляют собой материалы, отчасти имитирующие кожу. К наиболее распространенным для теста IVRT относятся мембраны из силикона, коллагена и поликарбонатные мембраны.

Использование разнообразных типов мембран для теста IVRT позволяет исследователям проводить более точные и разносторонние исследования, а также сравнивать результаты на различных моделях. Каждый тип мембраны имеет свои особенности и преимущества, и выбор оптимального варианта зависит от специфики и целей конкретного исследования.

Перед началом разработки метода IVRT производителю лекарственной формы или исследовательской организации необходимо установить параметры теста:

• мембрана (низкое связывание лекарственного средства, устойчивость к диффузии и химическая устойчивость к рецепторному раствору);
• дозировка продукта (решающее значение имеет последовательный и проверенный метод нанесения препарата на мембрану. Количество наносимого препарата должно быть одинаковым для всех образцов с отклонениями не более +/-5%. Это обеспечивает «псевдобесконечный» режим дозирования и сводит к минимуму эффект испарения);
• достаточная скорость перемешивания (которая не должна приводить к изменению на границе с мембраной и принимающей среды), что может повлиять на диффузию;
• концентрация действующего вещества (если его слишком мало, лекарственное средство в принимающем растворе может не определяться);
• время отбора проб (первая проба должна быть взята после того, как диффузионная ячейка достигнет устойчивого состояния диффузии, учитывая время задержки, а последняя проба должна быть взята во время устойчивого состояния до того, как произойдет чрезмерное истощение лекарственной формы от действующего вещества);
• принимающая (рецепторная) среда (достаточная растворимость и стабильность лекарственного средства в принимающей среде);
• аналитические методы (для точного определения количества активного ингредиента в получаемом растворе в различные моменты времени необходимы чувствительные, проверенные аналитические методы);
• вид аппарата IVRT (вертикальная диффузионная ячейка Франца (рис. 1) или иная).

Можно выделить две основные классификации ячеек: по типу исследуемого образца покрова и по типу нагрева. В зависимости от типа исследуемого образца покрова используют различные конфигурации ячеек:

• вертикальная для мембраны с плоской подложкой;
• вертикальная для «роговицы глаза» сферической формы с открытым верхом для, например, дневных глазных капель;
• горизонтальная для «роговицы глаза» сферической формы с закрытой ячейкой для лекарственного препарата;
• горизонтальная с плоским фланцем и закрытой ячейкой для лекарственного препарата для изучения его проникновения через стенки ЖКТ;
• вертикальная с полукруглой подложкой для ногтевых пластин и др.

Существуют также ячейки с дополнительным датчиком температуры в примембранной области, что позволяет изучать согревающие или охлаждающие лекарственные препараты.

Нагрев ячейки осуществляется для имитации температуры человеческого тела, поэтому в большинстве случаев рабочая температура составляет порядка +37°С.

В настоящее время твердотельный нагрев почти полностью вытеснил жидкостной, т.к. стоит меньше и является более надежным.

Без валидации метода IVRT полученные результаты могут быть неточными и ненадежными. Для получения значимых выводов необходимо убедиться, что метод и оборудование обладают необходимой сегрегационной способностью для точного определения «одинаковости» средств местного применения.

Приступая к валидации метода IVRT необходимо учитывать требования «Руководства по валидации аналитических методик по проведению испытаний лекарственных средств», утвержденной решением коллегии Евразийской экономической комиссии от 17.07.2018 № 113. Компоненты валидации:

1. Линейность и диапазон измерений – показывает, насколько хорошо зависимость между концентрацией действующего вещества и величиной аналитического сигнала (например, оптическая плотность) соответствует линейной модели в заданном диапазоне концентраций. Диапазон измерений – это область концентраций, в которой метод демонстрирует линейность и точность. Важно определить, насколько широкий диапазон концентраций может быть точно определен методом.
2. Точность и воспроизводимость: точность отражает близость измеренных значений к истинному значению действующего вещества. Воспроизводимость определяет, насколько близки друг к другу результаты, полученные при многократных измерениях одной и той же пробы.

Можно выделить три вида точности:

а) систематическая точность (смещение) – показывает, насколько измеренные значения систематически отклоняются от истинного значения;

б) случайная точность (разброс) – отражает случайные отклонения измеренных значений от истинного значения;

в) общая точность сочетает в себе влияние систематических и случайных ошибок.

3. Восстановление, баланс массы и уменьшение дозы: восстановление – это способность метода количественно определить действующее вещество, добавленное в матрицу образца. Баланс массы учитывает все компоненты образца. Он позволяет проверить, что метод не упускает из виду важные компоненты образца. Уменьшение дозы – это процедура, используемая для проверки того, что метод точно определяет действующее вещество в образцах с разными концентрациями.
4. Чувствительность и специфичность: чувствительность – это способность метода обнаруживать минимальное количество действующего вещества в испытуемом образце; специфичность – способность метода выявлять только конкретное действующее вещество без влияния других компонентов образца.
5. Селективность – способность метода различать разные компоненты образца. Это важно, когда в образце присутствуют составляющие, которые могут мешать определению действующего вещества.
6. Промежуточная прецизионность: промежуточная прецизионность оценивает вариабельность результатов, полученных при проведении анализа в разных условиях (разное оборудование, реактивы, разные операторы). Критерий приемлемости: CV (коэффициент вариации) < 10%.
7. Инертность мембраны (низкое связывание лекарственного средства, устойчивость к диффузии и химическая совместимость с принимающим раствором).
8. Растворимость действующего вещества в растворе.
9. Квалификация оборудования (этот параметр включает емкость ячейки и внутренний диаметр, поддержание температуры, скорость перемешивания и объем выдаваемого образца, а также параметры окружающей среды.
10. Валидация аналитического метода – это важный шаг для обеспечения достоверности и точности полученных результатов. Она гарантирует, что метод соответствует установленным стандартам и пригоден для решения конкретной аналитической задачи.

Неопределенность метода IVRT может возникать из-за различий в процедурах подготовки образцов, температурных условий, выбора рецептуры и других факторов. Для уменьшения неопределенности метода важно соблюдать стандартизированные процедуры, калибровать оборудование и контролировать условия эксперимента.

Построение графиков неопределенности метода IVRT может отражать различные параметры, такие как стандартное отклонение, доверительные интервалы и другие статистические показатели, позволяющие оценить степень неопределенности результатов.

В финале исследований разработчик должен представить:

• отчет о разработке метода IVPT;
• отчет(протокол) о валидации метода IVPT;
• отчет(протокол) об основном исследовании IVPT.

В процессе исследования эквивалентности проводятся тщательные сравнения между исследуемым препаратом и препаратом-референтом. Важно, чтобы сравнение включало также негативный контроль. Под негативным контролем подразумевается использование лекарственной формы, содержащей 50%-ную дозировку исследуемого препарата и обладающей аналогичными фармацевтико-технологическими характеристиками. Это позволяет более точно оценить, насколько измененная формула влияет на кинетику проникновения действующего вещества в дермальные слои кожи.

Данные испытания имеют критическое значение для разработки трансдермальных систем доставки. Они помогают разработчикам учитывать все аспекты, влияющие на эффективность и безопасность препаратов.

Практическая часть

Поскольку на начальном этапе проведения исследования IVPT необходимо обосновать вид выбранной мембраны, в данной работе было проведено сравнительное исследование некоторых доступных коммерческих мембран с целью установления возможности их использования для оценки скорости диффузии на примере модельного действующего вещества (диклофенака) и последующего выбора наиболее оптимальных образцов мембран. Диклофенак – достаточно распространенное НПВС, обладающее «сбалансированной» совокупностью строения и свойств: в составе молекулы имеет как гидрофобные, так и гидрофильные группы атомов (коэффициент распределения «октанол/вода» (logP) 4,4), хорошо растворим в метаноле, растворим в этаноле, практически нерастворим в хлороформе, рКа порядка 4,2 (что обеспечивает его нахождение в неонизированном состоянии в составе кремов и гелей, имеющих, как правило, рН в диапазоне 5,5–8,8).

Характеристики использованных образцов мембран приведены в таблице 1.

Микроструктура мембран была исследована с использованием электронного микроскопа Phenom ProХ (см. рис. 2–5).

Поскольку величина плотности потока обычно не представляет большого практического интереса, и более информативным является изменение концентрации во времени, в качестве практической величины нами была изучена зависимость изменения концентрации диклофенака от времени его диффузии через исследуемые мембраны. Были использованы следующие образцы, реактивы и оборудование: раствор диклофенака (концентрация 0,5 мг/мл) объемом по 5 мл в каждой пробе; принимающая среда – смесь 0,1М раствора хлористоводородной кислоты (30%) и этанола (70%) объемом 75 мл. Скорость вращения мешалки 200 об/мин. Температура 20–22°С, аналитический метод – спектрофотометрический (Спектрофотометр Shimadzu модели UV-1800, длина волны – 276 нм). При наличии предварительной подготовки мембран ее характер указан в таблице 1.

Результаты исследования диффузионной способности образцов мембран оценивались без количественного учета их толщины (по принципу «как есть»).

Выявленные зависимости изменения концентрации диклофенака в принимающей среде (в качестве опосредованной величины, соответствующей концентрации диклофенака, использовали оптическую плотность (А)) от времени диффузии через исследуемые мембраны в описанных выше условиях эксперимента приведены на рисунках 6–9. Из результатов исследования, приведенных в графической форме на рисунках 6–9, можно сделать следующие выводы:

1. Диффузионные процессы с использованием всех испытанных образцов мембран характеризуются приемлемой линейностью в испытанном временном диапазоне (коэффициент корреляции имеет значения от 0,9895 – для полиамидной мембраны до 0,9957 – для коллагеновой мембраны «Белкозин»).
2. Испытанные образцы коллагеновых и амидной мембран (несмотря на относительно большую их толщину (см. табл. 1) обеспечивают сравнительно высокую диффузионную способность по отношению к диклофенаку (А имеет значения от 0,32 – для коллагеновой мембраны «Фабиос», до 0,62 – для полиамидной мембраны). При этом достаточно тонкая (10 мкм) полиэтиленовая мембрана характеризуется сравнительно низкой диффузионной способностью (А = 0,21). Данные различия могут объясняться сравнительно высокой афинностью диклофенка к мембранам, имеющим в составе полярные группы и, соответственно, относительно низкой афинностью диклофенка к гидрофобной полиэтиленовой мембране.

В то же время, обращает на себя внимание различие диффузионной способности образцов двух коллагеновых мембран разных производителей («Белкозин» и «Фабиос»).

3. Полученные экспериментальные данные и теоретические положения могут свидетельствовать о том, что наиболее перспективными для дальнейшего изучения скорости диффузии диклофенака из мягких лекарственных форм в соответствии с предлагаемой методикой IVRT являются коллагеновые и полиамидные мембраны (в описанных выше условиях эксперимента). Для оценки перспективности полиэтиленовой мембраны необходимо проведение дополнительного исследования в условиях, отличных от использованных в данной работе и описанных выше.

Очевидно, что представленные нами результаты являются лишь определенным вкладом в накопление фактического материала по исследованию единичных и комплексных факторов, влияющих на способности различных мембран к диффузии актуального многообразия ДВ. Данные работы в настоящее время находятся на первоначальном этапе и, к сожалению, не носят системного характера.

Выводы

1. Установление характеристического профиля проникновения лекарственного препарата с использованием дискриминативного (функциональным синонимом является информативность) испытания на проникновение in vitro (IVPT) представляет собой важный аспект контроля качества и эффективности лекарственных средств. Это испытание помогает оценить, как изменения в технологической формуле препарата влияют на его способность проникать через кожный барьер на протяжении всего жизненного цикла. Важно отметить, что такие исследования не только необходимы для контроля качества, но и служат основой для обоснования эквивалентности нового препарата по сравнению с уже зарегистрированными.

Таким образом, исследования IVPT не только помогают обеспечить соответствие нормативным требованиям, но и играют ключевую роль в создании эффективных и безопасных лекарственных форм, что в дальнейшем может существенно влиять на разработку и коммерциализацию лекарственных средств.

2. В результате проведенного экспериментального исследования установлено:

2.1. Диффузионные процессы с использованием всех испытанных образцов мембран характеризуются приемлемой линейностью в испытанном временном диапазоне.

2.2. Испытанные образцы коллагеновых и амидной мембран обеспечивают сравнительно высокую диффузионную способность (скорость диффузии) по отношению к диклофенаку. Исследованный образец полиэтиленовой мембраны характеризуется сравнительно низкой диффузионной способностью. Указанные различия могут объясняться сравнительно высокой афинностью диклофенка к мембранам, имеющим в составе полярные группы и, соответственно, относительно низкой афинностью диклофенка к гидрофобной полиэтиленовой мембране.

Диффузионная способность образцов однотипных по химическому составу (коллагеновых) мембран разных производителей («Белкозин» и «Фабиос») различна.

2.3. Наиболее перспективными для дальнейшего изучения скорости диффузии диклофенака из мягких лекарственных форм в соответствии с предлагаемой методикой IVRT являются коллагеновые и полиамидные мембраны. Для комплексной оценки перспективности полиэтиленовой мембраны необходимо проведение дополнительных исследований в иных условиях.

1. Decision of the Council of the Eurasian Economic Commission dated November 3, 2016, No. 85 (as amended on April 12, 2024) “On approval of the Rules for conducting bioequivalence studies of medicinal products within the Eurasian Economic Union. Rules for conducting bioequivalence studies of medicinal products within the Eurasian Economic Union.” Appendix No. 13. Requirements for the quality and bioequivalence of medicinal products for topical use when applied to the skin and by other methods of local application. Appendix No. 1. In vitro release test (IVRT) methodology. (In Russian).
2. Decision of the Board of the Eurasian Economic Commission dated July 17, 2018 No. 113 “On approval of the Guidelines for the validation of analytical methods for testing medicinal products.” (In Russian).
3. Sushinskaya O.A., Golyak N.S., Tsarenkov V.M. Methods for studying the release of active substances from external drug forms // Vestnik farmacii. – 2019. – No.4. – P. 86–96. (In Russian).
4. Sintov A.C. Transdermal drug delivery using microemulsion and aqueous systems: Influence of skin storage conditions on the in vitro permeability of diclofenac from aqueous vehicle systems / A.C. Sintov, S. Botner // International Journal of Pharmaceutics. – 2006. – Vol. 311, № 1–2. – P. 55–62.
5. Lobanov M.L. Methods for determining diffusion coefficients: a tutorial / M.L. Lobanov, M.A. Zorin. – Ekaterinburg: Publishing house of the Ural. University, 2017, p. 6. (In Russian).