Background.

Одна из проблем, с которыми в настоящее время приходится сталкиваться в ходе исследований лекарственных препаратов, заключается в том, что ни один метод не может надежно измерить широкий спектр аналитов – от малых молекул до антител с реакцией, обеспечивающей точное количественное определение. Наиболее распространенным в фармакопейном анализе является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее – ВЭЖХ) с фотометрическим обнаружением в ультрафиолетовой/видимой части спектра (далее – UV/Vis). Гораздо реже используются системы ВЭЖХ, оснащенные масс-спектрометрическими детекторами (далее – MS). Другие детекторы имеют еще более ограниченное использование при исследовании лекарственных препаратов.

Широкое использование UV/Vis детекторов обусловлено их достаточно высокой чувствительностью, широким линейным диапазоном, сравнительно низкой стоимостью, простотой использования и совместимостью с большинством растворителей, используемых в подвижной фазе. Основным ограничением UV/Vis обнаружения является зависимость выявляемого ответа от наличия хромофора в соединении и его вида. При количественном определении, из-за разной чувствительности к аналиту, хроматографическая система нуждается в калибровке по индивидуальным стандартным образцам (калибрантам), а аналиты без хромофорных групп вовсе не могут быть обнаружены.

В то же время технология заряженного аэрозоля обеспечивает более универсальный и чувствительный способ обнаружения аналитов.

Основные принципы работы детектора заряженного аэрозоля

В связи с ограничениями применения традиционно используемых детекторов, связанными с трудоемкостью и времязатратностью процедур дериватизации, рациональным видится переход к использованию в ВЭЖХ так называемых универсальных детекторов. Среди них – детектор заряженного аэрозоля – charged aerosol detector (далее – CAD).

Впервые принципы работы CAD были предложены и реализованы в период 2002– 2005 гг. [1]. До этого в ВЭЖХ также использовались методы обнаружения на основе аэрозолей, при которых выходящий из колонки поток преобразуется в аэрозоль, но обнаруживается оптически. Авторы впервые описали новый метод обнаружения на основе аэрозоля для ВЭЖХ, назвав его обнаружением заряда аэрозоля. Детектор заряженного аэрозоля вскоре после 2005 года был запущен в производство и в настоящее время все чаще используется в различных производственных и исследовательских сферах, в том числе – в фармакопейном анализе.

Схематично работа CAD выглядит следующим образом.

1. Выходящий из колонки поток элюента распыляется в небулайзере и превращается в мелкодисперсный аэрозоль, капли которого далее сушатся. Число частиц увеличивается с количеством аналита.
2. Поток заряженного газообразного азота, сталкиваясь с частицами аналита, передает им свой заряд. Чем крупнее частица, тем больше заряд.
3. Заряженные частицы переносятся в коллектор, где совокупный заряд измеряется высокочувствительным электрометром. Это генерирует аналитический сигнал, прямо пропорциональный количеству присутствующего аналита.

Таким образом, при детектировании заряженных аэрозолей поток элюента распыляют, а капли сушат для получения частиц, которые затем заряжаются. Эта технология обеспечивает превосходную однородность отклика, поскольку заряд частиц не зависит от химической структуры анализируемого вещества. Однако при градиентном элюировании отклик CAD зависит от органического состава подвижной фазы. Его равномерность в случае классического градиентного элюирования не могла бы реализоваться без применения оригинальных решений. Так, для нивелирования влияния неоднородности состава подвижной фазы применена технология второго – обратного (компенсационного) градиента. Для ее реализации используется двухнасосная схема. Один насос обеспечивает прямой – аналитический градиент подвижной фазы через хроматографическую колонку, а другой, в обход колонки, – обратный градиент для достижения изократического потока в небулайзере. В результате детектор анализирует подвижную фазу постоянного состава, что и позволяет сохранить отклик, близкий к однородному, не зависящий от химической структуры аналитов.

CAD часто описывают как простой в использовании детектор, с повышенной чувствительностью, хорошей линейностью сигнала в более широком динамическом диапазоне концентраций даже по сравнению с рефрактометрическим детектором (RI) или детектором испарительного рассеяния света (ELSD)1. CAD позволяет осуществить относительное количественное определение, способное обнаруживать все нелетучие и многие полулетучие соединения, независимо от их химической структуры [2]. Например, в работе [3] на примере группы соединений (ацетаминофен, хлорамфеникол, кортизон, D-глюкоза, дибукаин, диклофенак, диурон, D-пантотеновая кислота, флуоресцеин, гуанин, гиппуровая кислота, лактоза, L-аскорбиновая кислота, мальтоза, родамин 800, сахарин, сахароза, триполидин, урацил, уридин) показано, что детектор CAD имеет равномерный ответ (отклонение RSD < 5%) среди использованных модельных нелетучих аналитов (на уровне 0,5 мкг). Это подтверждает уникальную возможность использования при количественном определении одного калибранта.

Высокая чувствительность CAD может быть полезна, например, при исследовании идентифицированных и неидентифицированных примесей разрабатываемых препаратов. Особенно это удобно, когда стандартные образцы конкретного аналита по какой-либо причине недоступны. При этом в качестве калибранта возможно использование любого активного фармацевтического ингредиента (далее – AФИ), входящего в состав препарата, как это представлено в работе [4]. Кроме того, в данной работе при количественном определении тенофовира и примесей в многокомпонентном лекарственном препарате (содержит аденин, эмтритабин, тенофовир, тенофовира дизопроксил) вместо традиционного двойного градиента для лучшего разделения критической пары пиков аденина и тенофовира с хорошим разрешением впервые предложен метод тройного градиента. В результате зарегистрирован одинаковый отклик CAD для всех нелетучих соединений, независимо от их химического состава, что позволило провести количественный анализ всех компонентов в образце с одним калибрантом, в качестве которого выступал тенофовира дизопроксил. Важно отметить, что создаваемый компенсационный (обратный) градиент является обязательно «зеркальным» по отношению к основному – аналитическому градиенту и требует в реальном анализе более тонких регулировок.

В ряде источников, в том числе [2] указано, что CAD представляет собой детектор, чувствительный к массовому расходу (отклик пропорционален массе аналита, достигающей детектора за единицу времени). В то же время исследователи [5] предложили поправочные коэффициенты, оценивающие относительную площадь поверхности частиц в детекторе с учетом влияния плотности и заряда аналитов. С учетом данных поправок количественная оценка с помощью калибровки площади поверхности, а не массы, показала улучшенную линейность и равномерность обнаружения, со снижением средней погрешности количественного определения 50 модельных соединений относительно 1H ЯМР с 11,4% до 7,1%.

Более того, проведенные этими же авторами аналогичные расчеты для высокоплотных соединений позволили снизить среднюю погрешность традиционной массовой калибровки с 34,7% до 5,8%. Следовательно, данные корреляции необходимо учитывать в алгоритмах, применяемых в соответствующих расчетах программного обеспечения систем ВЭЖХ-CAD.

Иные, влияющие на формирование универсального отклика, факторы (склонность отдельных аналитов к образованию солей с другими компонентами в подвижной фазе, их летучесть, поверхностное натяжение и вязкость смешанной подвижной фазы, температура испарения), также достаточно изучены [2].

При необходимости возможно составление мультидетекторных систем, которые создадут мощный инструмент для более глубокого анализа сложных образцов. Сочетание САD с UV/Vis-детектором позволит включить в круг исследуемых летучие соединения. Дополнительный МS-детектор используется для подтверждения идентичности состава или для идентификации неизвестных компонентов. Например, в работе [6] описано исследование по использованию мультидетекторной системы ВЭЖХ, включающей детекторы: UV/Vis, МS и САD. При этом было установлено, что при сравнении однородности ответа UV/Vis-детектора и CAD подтверждена способность CAD более точно определять количество неизвестных компонентов и его более высокая чувствительность к аналитам. Наряду с этим, не удалось обнаружить бисфенол А с использованием МS-детектора из-за влияния на аналит элюентов с низким значением рН. Полученные результаты подтверждают указанные выше положения об определенной ограниченности возможностей наиболее распространенных в фармацевтическом анализе детекторов UV/Vis и МS и преимуществе САD как универсального.

Метод ВЭЖХ-CAD в исследовании отдельных лекарственных препаратов

В настоящее время детектор CAD активно внедряется в фармакопейный анализ. Например, фармакопея США (монография USP 40-NF 35) описывает использование метода HPLC-CAD для измерения дезоксихолевой кислоты, ее основной примеси – холевой кислоты, а также некоторых мелких примесей [7].

В рамках модернизации монографии фармакопеи США (USP) 41(3) предложено изменение по метопрололу сукцинату (фармакопея США 38, стр. 4370) для определения органических примесей, у которых отсутствуют УФ-хромофоры. Традиционный метод ТСХ заменен методом хроматографии гидрофильного взаимодействия (HILIC) в сочетании с CAD [8].

Для анализа жирных кислот Европейская фармакопея описывает газовую хроматографию после дериватизации метанолом до метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК). При этом метод УВЭЖХCAD не требует дериватизации и недорог по сравнению с газовой хроматографией с масс-селективным детектированием (далее – ГХ-МС) [9].

Определение нативных аминокислот с детектором заряженного аэрозоля предусмотрено ОФС.1.2.1.0025.18. «Аминокислотный анализ», Метод 12 [10]. Метод характеризуется достаточно низким пределом обнаружения аминокислот на уровне от десятков до сотен нг. CAD характеризуется лучшей чувствительностью и более широким динамическим диапазоном по сравнению с испарительным детектором светорассеяния.

Разработан градиентный метод для одновременного анализа кислых, аминои некоторых нейтральных моносахаридов. Задача анализа сложных углеводов является трудоемкой из-за их гетерогенности и разнообразия, а также из-за присутствия эпимеров, образования аномеров и отсутствия хромофора в составе молекул. Общепринятые аналитические методы (ГХ–МС и обратнофазная ВЭЖХ) для анализа состава требуют соответствующей дериватизации моносахаридов. В то же время CAD имеет ряд преимуществ по сравнению с другими детекторами, используемыми для прямого анализа сахаров [11].

Кроме того, описано использование CAD для определения иных действующих и вспомогательных веществ биофармацевтических препаратов, таких как O-связанные гликаны, высвобождаемые из гликопротеинов путем восстановительного в-элиминирования; сиаловых кислот, адъювантов вакцин, белков, а также полисорбатов [12, 13], которые нашли применение в качестве солюбилизаторов и стабилизаторов в лекарственных средствах, содержащих в качестве действующего вещества белки и пептиды.

В Курском филиале ФГБУ «ИМЦЭУАОСМП» Росздравнадзора запланировано приобретение современной системы ВЭЖХ с детектором заряженного аэрозоля (ВЭЖХ-CAD), что даст возможность проводить исследования лекарственных препаратов с использованием данного метода.

Conclusion.

Таким образом, сравнительно новый универсальный детектор заряженного аэрозоля (CAD) обеспечивает улучшенную чувствительность для нелетучих и малолетучих соединений. Близкий к однородному отклик, не зависящий от химической структуры аналита, позволяет проводить количественное определение без использования индивидуальных стандартов – по любому известному калибранту. Во многих случаях CAD может устранить необходимость в дериватизации и тем самым снизить трудоемкость и временные затраты на пробоподготовку.

Универсальность детектора может использоваться для анализа лекарственных препаратов, в том числе входящих в их состав сахаров, углеводов, полимеров, поверхностно-активных и вспомогательных веществ.

______________________________________________________________________

1 В наличии в филиале г. Курск ФГБУ «ИМЦЭУАОСМП» Росздравнадзора.

1. Dixon R.W., Peterson D.S. Development and testing of a detection method for liquid chromatography based on aerosol charging. Anal Chem. 2002; 74:2930–7.
2. Menz M., Eggart B., Lovejoy K. [et al.] Charged aerosol detection – factors affecting uniform analyte response // Thermo Fisher Scientific, Chelmsford, MA, USA. – 16 p. – URL:https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Technical-Notes/tn-72806-uhplc-charged-aerosol-detection-tn72806-en.pdf.
3. HPLC-Charged Aerosol Detection. Surfactants and emulsifiers applications notebook // Thermo Fisher Scientific. – 53 p. – URL: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Application-Notes/ai-71101-hplc-cad-surfactants-emulsifiers-ai71101-en.pdf.
4. Lovejoy K. Quantitation of tenofovir and impurities in multi-component drug products by ternary gradient reversed-phase chromatography with charged aerosol detection // Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany. – 8 p. – URL: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FCMD%2FApplication-Notes%-2Fan-72944-lc-ternary-tenofovir-drugs-an72944-en.pdf.
5. Robinson M.W. [et al.] Use of calculated physicochemical properties to enhance quantitative response when using charged aerosol detection // Anal. Chem. – 2017, 89, 3, 1772–1777).
6. Meding St., Lovejoy K. [et al.] A Multi-Detector Set-Up Comprising of UV/Vis Detection, Charged Aerosol Detection and Single Quadrupole Mass Spectrometric Detection for Comprehensive Quantitative Sample Analysis // Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany – URL: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/posters/po-72726-lc-ms-multi-detector-UV/Vis-asms2018-po72726-en.pdf.
7. Lovejoy K., Gamache P., Muellner T. [et al.] Deoxycholic acid method transfer from the Corona ultra RS Charged Aerosol Detector to the Corona Veo (or Vanquish) Charged Aerosol Detector // Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany. – 7 p. – URL: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Application-Notes/an-72600-lc-cad-method-transfer-deoxycholic-acid-an72600-en.pdf.
8. Lovejoy K., Gamache P., Muellner T. [et al.] Metoprolol impurity testing by charged aerosol detection: method transfer and optimization of a USP method // Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany. – 7 p. – URL: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Application-Notes/an-72763-lcmetoprolol-charged-aerosol-detection-an72763-en.pdf.
9. Schilling K., Pawellek R., Lovejoy K., Muellner T., Holzgrabe U. Influence of charged aerosol detector instrument settings on the ultra-high-performance liquid chromatography analysis of fatty acids in polysorbate 80 // J. Chrom. A 2018, 1576, 58–66.
10. Государственная фармакопея Российской Федерации / Министерство здравоохранения Российской Федерации. – XIV изд. – Т.1. – Москва, 2018.
11. Ghosh R., Kline P. HPLC with charged aerosol detector (CAD) as a quality control platform for analysis of carbohydrate polymers // BMC Research Notes volume. 14 May 2019 URL: https://bmcresnotes.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13104-019-4296-y.
12. Long Z., Shen G., Neubauer M., Lovejoy K., Liu L., Liu X., Jin Y., Liu X. A highly sensitive high-performance liquid chromatographycharged aerosol detection method for the quantitative analysis of polysorbate 80 in protein solution // Thermo Fisher Scientific, Shanghai, People’s Republic of China. – 5 p. – URL: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Application-Notes/AN-72398-HPLC-CAD-Polysorbate-80-Protein-Solution-AN72398-EN.pdf.
13. Grokhovskiy V.I. Определение полисорбатов в биотехнологических препаратах / В.И. Гроховский, А.А. Бендрышев, С.В. Швец, Д.А. Орлов, О.А. Ваганова // Разработка и регистрация лекарственных средств. – 2017. № 2 (19) – С. 160–165.